阿托伐他汀對膿毒癥大鼠血漿IL-1β的影響

顧金萍，于 健, 王俊松，王之余，曲茂興

(1.大連醫科大學 附屬第二醫院 重癥醫學科， 遼寧 大連 116027；2.大連大學 附屬新華醫院 重癥監護病房， 遼寧 大連116001)

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的臨床疾病，為機體局部感染，毒素吸收或者病原微生物直接入血彌漫全身所致。是嚴重創傷、休克、感染、外科大手術患者常見的并發癥，進一步發展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，是臨床危重患者最主要的死亡原因之一[1]，而Sepsis是否引起死亡主要取決于機體對炎癥的反應及其炎癥因子的釋放強度。目前，對膿毒癥的發病機制尚未完全闡明，病因治療、液體復蘇、血管活性藥物治療、抗生素的使用及抗凝治療等仍然是目前的主要治療手段，盡管上述治療手段不斷改進，但膿毒癥或膿毒性休克的死亡率仍居高不下，為30%～50%[2]。

他汀類藥物是目前廣泛應用的調脂藥物，臨床上主要用于高脂血癥、冠心病等疾病的治療。但是近期的研究顯示他汀類藥物對內毒素血癥的患者有益。膿毒癥是細菌感染的嚴重階段，涉及到多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白細胞介素1、6、8(IL-1,IL-6,IL-8)等,而他汀類藥物改善患者的預后可能與抑制炎癥因子的釋放有關。本研究的目的是觀察他汀類藥物對膿毒癥小鼠血IL-1β濃度的影響，從而進一步明確他汀類藥物干預炎癥過程的機制。本實驗采用盲腸結扎穿孔術(CPL)建立膿毒癥大鼠模型，動態觀察IL-1β的變化以及阿托伐他汀對它們的影響，探討他汀類調脂藥對于膿毒癥臨床治療的應用價值。

1 材料和方法

1.1 儀器設備

DS-88型電子秤(武漢自動化儀表廠)，TG16WS高速臺式離心機(長沙科學儀器廠)，HH-W21-600電熱恒溫水浴箱(上海醫用恒溫設備廠)，邁瑞MR96A酶標儀。

1.2 試劑和材料

阿托伐他汀(立普妥)，20 mg/片，大連輝瑞制藥有限公司生產，批號081128。麻醉劑：3%戊巴比妥鈉。制作模型的耗材：愛惜康(黑色)編織非吸收性縫線，15 cm×60 cm，由Johnson 公司生產。KGERC102a凱基大鼠IL-1β ELISA 試劑盒，由南京凱基生物科技發展有限公司生產。

1.3 實驗動物分組及給藥

100只健康雄性S-D(Sprague-Dawley)大鼠，體質量184～202 g，購于大連醫科大學實驗動物中心。在實驗室內飼養，環境溫度22～25 ℃，空氣濕度40%～70%。每5只大鼠置一籠(475 mm×300 mm×200 mm)，在籠內自由活動，攝取全價配合飼料(大連醫科大學實驗動物中心提供)并自由飲水，自然長度的晝夜循環。按照隨機排列表法分為對照組，膿毒癥組，阿托伐他汀低劑量組，阿托伐他汀高劑量組，每組25只。對照組用淀粉40 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液灌胃5 d，術前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無菌條件下取下腹正中切口2 cm，翻動盲腸后還納腹腔，逐層縫合切口，置籠內活動，不禁飲食。膿毒癥組術前灌胃與對照組相同，采用盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and puncture, CLP)制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀低劑量組用研缽粉碎阿托伐他汀，以20 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續灌胃5 d，采用CLP制作膿毒癥大鼠模型。阿托伐他汀高劑量組用研缽粉碎阿托伐他汀，以40 mg/kg·d加入2 mL生理鹽水制成混懸液連續灌胃5 d，采用CLP制作膿毒癥大鼠模型[3]。

1.4 盲腸結扎穿孔術(CLP)

術前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無菌條件下取下腹正中切口2 cm，暴露盲腸，用絲線結扎盲腸總長度的30%[4]，注意避開系膜血管，9號注射針頭在盲腸游離端選2個相距3 mm點分別刺孔穿透盲腸，然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合切口，即刻皮下注射生理鹽水3 mL/100 mg體重以補充術中丟失的液體。術后置籠內活動，不禁飲食。

1.5 大鼠膿毒癥嚴重程度評分標準

采用改良的評定標準[5]進行評分。見表1。

1.6 標本收集

分別于術后0，3，6，12及24 h 各取5只大鼠麻醉后，剪去一側頸部外側被毛，剪開皮膚，剝離組織，找到頸靜脈或動脈后，用注射器采血，在采血管中再靜置30 min, 4 ℃以4000 r/min離心15 min, 分離出血漿后-80 ℃冰箱中保存。

1.7 標本檢測

IL-1β應用凱基大鼠 IL-1β ELISA 試劑盒測定。

1.8 組織病理觀察

各組分別在術后0、24 h留取空腸標本，置10%甲醛溶液中固定，依次進行常規脫水、石蠟包埋、制成切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差表示，正態分布變量多組間的比較用方差分析，非正態分布變量用秩和檢驗，4個處理組之間均數兩兩比較用LSD-t檢驗法，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況

膿毒癥大鼠逐漸出現活動少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光澤，停止飲水，豎毛，有些大鼠呼吸快，眼睛變雙環，對被動仰臥無反抗，感覺遲鈍，短期內病死率高。腹腔腸系膜充血，腸管顯著擴張，結扎盲腸壞死，血性腹水，病灶處大網膜包裹不佳，肝腫大，肺表面充血明顯等。低劑量阿托伐他汀組出現厭食，豎毛，活動少甚至不活動等情況，腸管輕度擴張，腹水微臭，壞死盲腸被大網膜及周圍腸管包裹良好，但局部可見壞死。高劑量阿托伐他汀組亦出現厭食，豎毛，活動少等情況，腸管輕度擴張腹水減少，壞死盲腸被大網膜及周圍腸管包裹明顯，對照組沒有相關表現。各組大鼠膿毒癥嚴重程度評分見表2。

表2 四組大鼠膿毒癥嚴重程度評分比較Tab 2 Comparison of sepsis severity scale in four groups

1)與對照組相比，P<0.01；2)與膿毒癥組相比，P<0.01；3)與低劑量組比，P<0.01

2.2 各組血漿IL-1β濃度的比較

0 h各組血漿IL-1β濃度比較差異無顯著性意義(P=0.772，P>0.05)。對照組血漿IL-1β濃度變化不明顯，在3 h、6 h、12 h、24 h膿毒癥組和對照組、阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。膿毒癥組血漿IL-1β濃度在術后3 h顯著升高，6 h達到峰值(1373.90±495.26)ng/L之后逐漸下降。阿托伐他汀組血漿IL-1β濃度同樣在術后3 h顯著升高，在6 h達到峰值，低劑量組(876.70±137.87)ng/L，高劑量組(669.40±71.23)ng/L，較膿毒癥組明顯降低(P低=0.001，P高=0.001，P均<0.01)，差異具有非常顯著性意義。12 h阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿IL-1β濃度明顯降低(P=0.002，P<0.01)，差異具有非常顯著性意義。24 h阿托伐他汀高劑量組較阿托伐他汀低劑量組血漿IL-1β濃度也有明顯降低(P=0.042，P<0.05)，差異具有顯著性意義。見表3。

表3 阿托伐他汀對膿毒癥大鼠血漿IL-1β濃度的影響Tab 3 Effect on the plasma levels of IL-1β in sepsis rat (ng/L)

1)與對照組相比，P<0.01;2)與膿毒癥組相比，P<0.01;3)與低劑量組相比，P<0.01;4)與低劑量組相比，P<0.05

2.3 大鼠大體解剖檢查

對照組無明顯病理改變。膿毒癥組均出現嚴重的腹腔炎癥，腹腔內有多量渾濁膿性滲出液，可見有血性腹水，腸管水腫粘連，盲腸腫脹壞疽，肝、腎充血腫大。阿托伐他汀低劑量組膿性滲出液略少，腸管粘連較膿毒癥組輕，盲腸腫脹壞疽減輕。高劑量組較低劑量組膿性滲出液少，盲腸腫脹壞疽輕。

2.4 光學顯微鏡下小腸的病理改變

對照組腸黏膜正常。膿毒癥組腸黏膜部分上皮脫落，重度炎癥。阿托伐他汀組腸黏膜中度炎癥。高劑量組較低劑量組炎癥程度減輕。見圖1。

圖1 大鼠小腸24 h病理改變(HE ×200)Fig 1 Pathological change on small intestine of rats after 24 h (HE ×200)

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，其過程涉及炎癥、免疫、凝血及組織損害等一系列的機體變化，最終導致多器官功能衰竭。雖然近年來對人體炎癥反應的病理生理有了突破性的認識，并采取了一些有效的治療技術，但是重癥膿毒癥的死亡率仍然保持在40%[6]，在合并臟器衰竭和休克的患者，有些甚至已超過了50%。免疫系統參與了膿毒癥的發病過程，近年來的研究顯示[7]，膿毒癥表現為兩個階段，第一階段主要為前炎因子的表達，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素-1(IL-1)， 白細胞介素-8(IL-8)，白細胞介素-12(IL-12), 可能有白細胞介素-6(IL-6)的表達，對有效的炎癥反應來說，前炎因子是有益的，但是過度的表達就導致了器官功能不全，增加了死亡率；而在第二階段，抗炎因子，如白細胞介素-10(IL-10)，白細胞介素-13(IL-13)，白細胞介素-4(IL-4)和前列環素E2的釋放中和了炎癥反應，使其避免過度的表達，以致造成器官功能損害。美國學者Bone[8]于20世紀90年代中期提出了代償性抗炎反應綜合征的假說， 指出膿毒血癥患者存在不同的免疫狀態(包括免疫抑制)，主要取決于促炎細胞因子與抗炎細胞因子的平衡，免疫抑制是由于抗炎因子占優勢所致。20世紀70年代在對免疫應答的研究過程中，人們從絲裂源刺激的細胞培養上清液中發現了許多的具有生物活性的分子，包括IL-1，研究表明LPS是單核∕巨噬細胞合成和分泌IL-1的強烈刺激劑，研究IL-1在膿毒癥發病機制中的作用發現IL-1可通過多種途徑產生多種效應來介導機體炎癥反應。IL-1分子量為17.5 kD，有兩種類型：IL-1α和IL-1β，主要以IL-1β為主。所以本實驗研究阿托伐他汀對膿毒癥大鼠IL-1β的影響，以了解阿托伐他汀是否會影響膿毒癥大鼠IL-1β水平，從而對抗膿毒癥治療有影響。

他汀類藥物是羥甲基戊二酸輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，干擾膽固醇代謝，是目前廣泛應用的調脂藥物，臨床上主要用于高脂血癥、冠心病等疾病的治療。但是大量研究證明他汀類藥物對膿毒癥有益。首先在一些動物實驗中得到證明，Merx等[9]采用盲腸結扎穿孔術(CLP)復制小鼠膿毒癥模型, 研究表明, 經過他汀類藥物預處理的小鼠的平均存活率是對照組的4倍。實驗動物制造模型的方法既往有利用細菌脂多糖誘導的方法。本研究采用CLP法復制膿毒癥動物模型，其機理是通過盲腸的結扎和穿孔，使有菌的腸內容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發全身炎癥反應，與利用細菌脂多糖(LPS)誘導的大鼠休克模型進行的研究相比，更能反映膿毒癥的病理生理變化，更貼近于臨床。因為在臨床上調脂藥物中阿托伐他汀療效確切，應用廣泛，所以本研究中調脂藥物選擇了阿托伐他汀，而不是其他調脂藥物。本研究結果提示膿毒癥組的大鼠逐漸出現活動少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光澤，停止飲水，豎毛。阿托伐他汀低劑量組出現厭食，豎毛，活動少甚至不活動，腸管輕度擴張，腹水微臭，壞死盲腸被大網膜及周圍腸管包裹良好，但局部可見壞死。高劑量阿托伐他汀組亦出現厭食，豎毛，活動少等情況，腸管輕度擴張腹水減少，壞死盲腸被大網膜及周圍腸管包裹明顯。可能提示阿托伐他汀有抑制膿毒癥反應的作用。本研究結果提示，膿毒癥組IL-1β較阿托伐他汀組均明顯升高，并且高劑量阿托伐他汀組的IL-1β低于低劑量組，提示阿托伐他汀可能具有抗膿毒癥作用。比較大鼠大體解剖發現對照組無明顯病理改變。膿毒癥組均出現嚴重的腹腔炎癥，腹腔內有多量渾濁膿性滲出液，可見有血性腹水，腸管水腫粘連，盲腸腫脹壞疽，肝、腎充血腫大。比較光學顯微鏡下小腸的病理改變，發現對照組腸黏膜正常。膿毒癥組腸黏膜部分上皮脫落，重度炎癥。阿托伐他汀組腸黏膜中度炎癥。高劑量組較低劑量組炎癥程度減輕。進一步提示阿托伐他汀可以抑制動物膿毒癥反應，主要體現在動物表現以及血漿IL-1β的治療有益方面。不只是在動物實驗中證明有效，越來越多的臨床研究顯示，他汀類藥物不但有降脂作用，還可以抑制炎性因子的釋放，抑制炎性細胞的黏附，降低膿毒血癥的發生率和病死率[10]。一項前瞻性研究證實，患有急性細菌感染的患者，若預先服用他汀類藥物，則嚴重膿毒癥的發病率及ICU住院率均下降[11]。Thomsen等[12]研究阿托伐他汀對細菌感染后患者的短期病死率沒有影響，但是卻可以明顯改善細菌感染后30～180 d的病死率 。有關他汀類藥物成為近年膿毒癥治療研究的熱點，其主要機制之一可能與保護血管內皮功能有關。有臨床觀察研究表明，他汀類藥物治療對膿毒癥患者有益。Kruger等[13]對438例患者中66例 (占總人群的15%)入院前正在服用他汀類藥物，而且其中85%患者入院后仍繼續接受他汀類藥物治療進行的回顧性調查研究發現，他汀類藥物治療對膿毒癥患者有益，他汀治療組與對照組相比，28 d總病死率(10.6% vs 23.1%，P=0.022)和由膿毒癥所致的病死率(6.1% vs18.3%,P=0.014)顯著下降。Almog等[14]在對肺炎、泌尿系感染和蜂窩織炎患者(這些患者的APACHEⅡ評分11.1±7.2)的前瞻性隊列研究中也表明，他汀類藥物可降低嚴重膿毒癥發生率和ICU住院率。雖然目前大多數的研究結果支持他汀類藥物能改善膿毒血癥的預后，但需要有大樣本的前瞻性的隨機對照研究結果來證實。

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