Bmi-1 siRNA對宮頸癌Hela細胞體外增殖能力的影響

劉丹丹，姜 悅，劉 奔，劉純青，魏 巍，張艷麗，>趙心宇，趙寶霞，孟秀香

(1.大連醫科大學 診斷學實驗中心，遼寧 大連116044；2.黑龍江省雙鴨山市疾控中心，黑龍江 雙鴨山155100；3.大連醫科大學 檢驗醫學院，遼寧 大連116044；4.山東省濟南市第五人民醫院 檢驗科，山東 濟南250022)

Bmi-1基因(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族中重要成員之一[1]。Bmi-1基因決定著某些腫瘤干細胞自我更新能力，如白血病干細胞[2]、神經腫瘤干細胞[3]和乳腺癌干細胞[4]等。很多臨床研究發現Bmi-1基因與多種腫瘤關系密切，在神經膠質瘤、乳腺癌、肝癌、直腸癌及胃癌等中均發現Bmi-1表達較正常組織增高，且這種表達的增高與腫瘤組織特性(如癌組織大小、分期分級、病程、轉移程度等)的相關性研究表明，Bmi-1與腫瘤的惡性程度、侵襲、轉移及預后關系密切[5-7]。本文旨在研究Bmi-1 siRNA沉默Hela細胞中Bmi-1表達對Hela細胞增殖能力的影響，并探討其機制。

1 材料和方法

1.1 siRNA重組質粒的構建與轉染

根據GENEBANK中的Bmi-1 mRNA Sequence NM_005180，設計4條Bmi-1 siRNA序列和一條隨機序列的陰性對照(表1)。將合成siRNA小片段與進行BamHI+HindIII雙酶切的質粒pGenesil-2進行表達載體連接，獲得連接有各siRNA小片段的重組質粒。利用FuGENE?HD 試劑(Roche公司)將重組質粒分別轉染入Hela細胞中，轉染siRNA干擾質粒的Hela細胞分別命名為Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4細胞，轉染隨機系列陰性對照質粒的Hela細胞命名為Hela-V細胞，未轉染的Hela細胞命名為Hela-W細胞。將細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養。質粒pGensil-1(由武漢晶賽公司提供)含有EGFP基因能表達熒光蛋白，用于熒光顯微鏡觀察轉染效率。

表1 Bmi-1 siRNA序列Tab 1 The siRNA target sequence of Bmi-1 gene

1.2 Bmi-1mRNA水平檢測

采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測Bmi-1 mRNA。Bmi-1基因上游引物：5′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3′，Bmi-1基因下游引物：5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′，擴增片斷長度為221 bp。以GAPDH作為內參照基因；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，GAPDH下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴增片斷長度為226 bp。引物由大連寶生物公司合成。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。紫外凝膠成像系統記錄結果。電泳條帶強度由圖像分析系統進行分析。

1.3 蛋白水平檢測

采用Western blot法。轉染48 h后收集細胞，按南京KEYGEN公司的說明書提取蛋白。蛋白樣品經15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜(Millipore 公司)，之后與一抗(Bmi-1，CyclinD1，β-actin，Abcam公司)室溫振蕩孵育2 h，再分別與相應二抗(北京中杉公司)37 ℃孵育1 h，ECL化學發光試劑(北京普利萊公司)檢測陽性信號，拍照，凝膠圖像處理系統分析。

1.4 細胞存活率檢測

轉染48 h后收集細胞，用0.4%臺盼藍進行染色，分別計數100個細胞中的死亡細胞數，計算細胞存活率。

1.5 增殖能力的檢測

采用MTT法檢測Hela細胞的增殖能力。轉染48 h后，取4組細胞接種在96孔板中，1 d后每孔加入MTT 10 μL培養4 h，然后加入150 μL DMSO，待結晶完全溶解后，用酶標儀測定吸光度值，檢測波長為492 nm。連續測5 d。

1.6 細胞周期的檢測

轉染48 h后收集細胞，用70%乙醇4 ℃固定24 h，加入RNA酶(終濃度50 μg/mL)，37 ℃1 h。加入碘化丙啶(PI，濃度100 μg/mL)溶液染色20～30 min后，在流式細胞儀上進行檢測分析。

1.7 克隆形成能力檢測

采用平板克隆形成實驗：轉染48 h后，在六孔板的每個孔中加入400個細胞，培養10 d待細胞形成克隆后，10%甲醛固定20 min后加入結晶紫染液染15 min，用數碼相機拍照。計數肉眼可見的集落數。

1.8 Ki-67的檢測

Ki-67一抗購自SANTA CRUZ公司；二抗及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。將已消毒的蓋玻片置于培養皿中，加入細胞懸液后正常培養細胞進行爬片，2 d后免疫組織化學SP法進行染色。具體操作步驟(按試劑盒說明書進行)如下：PBS中清洗爬片3次，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，0.5%Triton X-100透膜處理，正常非動物免疫血清封阻，加Ki-67抗體4 ℃孵育過夜。次日，分別與二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶常溫孵育，再經DAB顯色、蘇木染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后以中性樹脂封片，復光鏡

下觀察。此外，陰性對照片以PBS代替一抗。根據染色強度即棕色的強弱來進行定性判斷。

1.9 統計學方法

用SPSS13.0軟件進行統計學處理。統計數據用mean±SD表示，采用方差分析對實驗結果進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hela細胞轉染Bmi-1 siRNA后轉染效果的觀察

轉染48 h后，提取6組細胞總RNA，進行RT-PCR反應檢測Neo基因的表達，結果見圖1。Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4及Hela-V細胞中均有Neo基因的表達，而Hela-W細胞中未見Neo基因的表達。同時將質粒pGensil-1轉染入Hela細胞，48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率(圖2)。轉染效率達90%左右。

圖1 6組細胞中Neo基因表達結果

Fig 1 Confirmation of plasmid transfection by antineomycin mRNA expression Lane M：DL2000；Lane 1、Lane 2、Lane 3、Lane 4、Lane 5、Lane 6分別為Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3、Hela-S4、Hela-V和Hela-W

圖2 質粒pGensil-1轉染Hela細胞后熒光觀察 ×100Fig 2 Efficiency of plasmid transfection ×100

2.2 轉染Bmi-1 siRNA對Bmi-1表達的影響

轉染48 h后，提取6組細胞總RNA，進行RT-PCR反應檢測Bmi-1與GAPDH mRNA的水平，結果見圖3A。結果顯示：Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3和Hela-S4細胞中Bmi-1 mRNA表達量與Hela-V和Hela-W兩組細胞比較差異有顯著性意義，P<0.01。Hela-V組與Hela-W組比較差異無顯著性意義，P>0.05。Western blot分析6組細胞中Bmi-1與β-actin蛋白的表達見圖3B。結果顯示，Hela-S1、Hela-S2、Hela-S3和Hela-S4細胞中Bmi-1蛋白表達量與Hela-V和Hela-W兩組細胞比較差異有顯著性意義，P<0.05;而Hela-W與Hela-V組比較差異無顯著性意義，P>0.05。

圖3 siRNA對Hela細胞Bmi-1表達的影響Fig 3 Effects of Bmi-1 siRNA on Bmi-1 expression and protein translation in Hela cellsA：Bmi-1 mRNA表達；B：Bmi-1蛋白表達

如圖3所示，4條干擾鏈均能抑制Hela細胞中Bmi-1 mRNA及Bmi-1蛋白的表達，選用Hela-S1鏈和Hela-S3鏈進行后續實驗。

2.3 轉染Bmi-1 siRNA對Hela細胞增殖的影響

臺盼藍染色計數細胞的存活率，轉染組與對照組比較差異無顯著性意義，P>0.05(圖4A)。MTT法結果顯示：第2天開始Hela-S1和Hela-S3細胞生長速度明顯減慢(P<0.05)，而Hela-W與Hela-V組比較差異無顯著性意義，P>0.05(圖4B)。流式細胞術分析細胞周期分布結果為：Hela-W和Hela-V細胞G0-G1期比率是(54.73±4.19)%和(54.96±5.37)%，Hela-S1和Hela-S3組的比率則分別為(76.92±8.25)%和(77.85±6.32)%。與Hela-W和Hela-V比較差異有顯著性意義，P<0.05，而Hela-W與Hela-V組比較差異無顯著性意義，P>0.05。

圖4 Bmi-1 siRNA對Hela細胞增殖的影響Fig 4 Effects of Bmi-1 siRNA on proliferation of Hela cellsA：臺盼藍實驗結果；B:細胞生長曲線*與其他兩組細胞相比P<0.05

2.4 轉染Bmi-1 siRNA對Hela細胞體外克隆形成能力的影響

將Hela-S1、Hela-S3、Hela-W、Hela-V各組400個細胞接種于六孔板中，10 d后各組細胞形成的集落經結晶紫染色，計數肉眼可見的克隆數目，結果發現Hela-S1、Hela-S3細胞形成的克隆數目與對照組比較差異有顯著性意義，P<0.01，克隆的直徑明顯變小，見圖5。

圖5 Bmi-1 siRNA對Hela細胞集落形成的影響Fig 5 Effects of Bmi-1 siRNA on colony formation of HeLa cells

2.5 轉染Bmi-1 siRNA對Hela細胞Ki-67及CyclinD1表達的影響

組化染色結果顯示Bmi-1沉默后Ki-67明顯下降(圖6)；Western blot結果表明：Bmi-1沉默后CyclinD1表達亦明顯下降(圖7)。

圖6 Bmi-1 siRNA對Hela細胞Ki-67表達的影響

圖7 Bmi-1 siRNA對Hela細胞CyclinD1表達的影響

Fig 7 Effect of Bmi-1 siRNA on CyclinD1 expression of Hela cells were analyzed by Western blot

3 討 論

Xiao J等[8]發現沉默Bmi-1表達能夠抑制胃癌細胞的增殖與侵襲，筆者在前期研究中也發現反義RNA能夠抑制肺腺癌系A549細胞的增殖[9]。本研究設計了4對針對Bmi-1基因的siRNA及陰性對照的siRNA。發現這4條Bmi-1 siRNA均能沉默Hela細胞Bmi-1基因的表達，便隨機選用Hela-S1、Hela-S3條Bmi-1 siRNA作后續實驗。

臺盼藍結果顯示，干擾組與對照組死亡細胞率相比差異無顯著性意義，說明Bmi-1 siRNA不會引起Hela細胞的死亡。MTT結果顯示，第2天開始Hela-S1、Hela-S3細胞的A值與對照組相比明顯降低，生長速度明顯減慢。說明Bmi-1 siRNA是通過抑制Hela細胞的生長速度來抑制其增殖的。而應用流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況的結果顯示，表達Bmi-1 siRNA的質粒使停滯于G0-G1期的Hela細胞明顯增多。說明Bmi-1 siRNA可能是通過阻斷細胞周期來抑制Hela細胞增殖的。平板克隆形成實驗結果顯示，Hela-S1、Hela-S3細胞形成的克隆數目與對照組相比明顯減少(P<0.01)，克隆的直徑明顯變小，表明Bmi-1 siRNA抑制Hela細胞中Bmi-1基因的表達對Hela細胞自我更新能力產生了明顯的抑制作用。

Bmi-1和腫瘤發生之間最直接的聯系就是Bmi-1可以抑制Ink4a/Arf位點的表達，并因此調節細胞周期和細胞增殖。Ink4a/Arf位點是Bmi-1的經典靶基因，該位點可編碼2種蛋白質：p16Ink4a和p19arf(在人類為p14Arf)。最近Wu J等[10]發現Bmi-1可通過p16ink4a/CDK4通路調控鼻咽癌細胞的增殖。而Xu Z等[11]發現Bmi-1還可通過調節CyclinD1等細胞周期蛋白參與乳腺癌細胞的增殖。本研究結果顯示Bmi-1表達沉默的同時，CyclinD1表達明顯下降，Bmi-1是通過p16ink4a/CDK4通路還是PI3K/Akt通路來調控CyclinD1還有待于進一步探討。

Ki-67是一種細胞核增殖抗原，是公認的準確可靠的監測細胞增殖狀態的指標，近年來被認為能較有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要標記物之一。因為其半衰期不超過1 h，陽性表達又覆蓋了各種增殖期細胞整個有絲分裂期，能夠減少在檢測過程中出現假陰性或假陽性的結果。因而本實驗檢測了各組Hela細胞Ki-67的表達情況，結果發現Bmi-1表達沉默后Ki-67表達明顯下降，說明二者密切相關，也為Bmi-1促進Hela細胞增殖提供了更有力的證據。

本研究利用Bmi-1 siRNA來干擾Bmi-1基因表達，發現其抑制了Hela細胞的體外增殖及克隆形成能力，同時Ki-67和CyclinD1的表達明顯下降，說明Bmi-1參與了宮頸癌的發生過程。可以推測Bmi-1有望成為一個新的宮頸癌細胞標志物和作為針對腫瘤干細胞治療的靶基因。

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