利用熒光MFLP標記技術分析煙草種質的遺傳多樣性

何其芳，李榮華，郭培國*，寧正祥，邱妙文，趙偉才，陳俊標，夏巖石，白 盼

（1.廣州大學植物抗逆基因功能研究廣州市重點研究室，生命科學學院，廣州 510006；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510640；3.廣東省煙草公司南雄科學研究所，廣東 南雄 512400；4.廣東省農科院作物研究所，廣州 510642）

微衛星錨定片段長度多態性（ Microsatellite-anchored fragment length polymorphism, MFLP）是2001年由Yang等[1]利用AFLP和SSR錨定引物技術的雙重原理創立了一種新型的分子標記技術，其實質是同時探查限制性內切酶酶切位點和限制性片段內堿基序列、微衛星重復基元的變異，具有AFLP多態性豐富和具有SSR共顯性等優點[2]。另外，MFLP多態性不需經過冗長繁瑣的實驗過程，就能轉化獲得序列特異性的SSR或PCR標記[1,3]。利用該技術，分析了多種作物的生物多樣性、構建了遺傳連鎖圖、并發現了與抗病性和品質相關的MFLP標記[1,3-5]。

煙草是重要經濟作物之一，但在利用分子標記技術方面，與其他作物相比，仍有較大差距。主要體現在大量研究主要利用穩定性和重復性較差的RAPD技術[6-7]，近來有報道利用AFLP技術開展煙草材料的遺傳多樣性分析[8-9]；而煙草 SSR標記技術的研究起步晚，直到2007年Bindler等[10]首次報道如何開發煙草的SSR標記，并利用開發出的282個 SSR標記構建了遺傳連鎖圖譜。隨后利用這些SSR標記，分析了煙草品種的多樣性及進化關系等[11-13]，但在種質遺傳多態性分析實驗中發現這些SSR在烤煙上只有20個能擴增出具有明顯SSR特性（如共顯性）的擴增條帶[13]。直到現在還未見利用MFLP技術開展煙草遺傳特性分析方面的研究報道。另外，MFLP技術均采用放射性同位素進行標記[1,4-5]，該技術存在著一系列令人困擾的問題，通常在普通實驗室中難以開展，如果能將熒光標記技術成功運用到MFLP中將能夠大大提高實驗的安全性并降低實驗成本，更加有利于MFLP技術的發展。

本研究以 32份煙草種質為材料，利用我們建立的煙草MFLP熒光標記分析體系，將M13通用熒光接頭連接在設計的 SSR錨定引物上對擴增產物進行熒光標記，并對煙草種質材料進行多態性分析，為熒光MFLP技術在煙草遺傳多樣性及其他遺傳特性分析的研究和應用提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 煙草種質材料及基因組DNA的提取

本試驗選用的 32份煙草種質材料由廣東省農科院作物所提供，種質材料的序號、名稱、來源和類型如表1所示。2010年盆栽種植煙草各材料，在幼苗期采收葉片，按李榮華等[14]改良的CTAB法，提取各材料的基因組DNA，并將提取的煙草DNA濃度稀釋到100 ng/μL后作為MFLP的模板。

表1 煙草種質材料及來源Table 1 Tobacco germplasm and origins

1.2 引物和試劑

熒 光 引 物 M13-F-IRDye 700（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）購自美國LICOR公司，SSR錨定引物、帶M13接頭的SSR錨定引物（即加尾 SSR錨定引物）、MseI接頭和MseI引物、實驗所需的酶及試劑均購自上海生物工程有限公司合成。MFLP中使用的引物信息見表2。

表2 MFLP預擴增和選擇性擴增的引物Table 2 MFLP primers used in pre- and selective-amplification

1.3 熒光MFLP標記技術

依據Yang等[1]MFLP技術的原理，結合熒光標記技術，建立了煙草熒光MFLP標記技術，具體過程如下：

1.3.1 酶切和連接 取MseI adapter-1（100 pM）和MseI adapter-2（100 pM）各 62 μL，混均后在 95 ℃水浴5 min，取出后放在操作臺上冷卻20 min，作為MseI adapter備用。MseI酶切反應液總體積為30 μL，包括 DNA（100 ng/μL）3.0 μL，MseI酶（10 U/μL）0.6 μL，10×buffer R 3.0 μL，雙蒸水 23.4 μL，在 37℃條件下酶切2 h，之后在80 ℃條件下保溫20 min終止反應；之后在MseI酶切產物中加入MseI adapter 1 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA 連接酶(5 U/μL) 0.2 μL，雙蒸水 6.8 μL，在 20℃條件下反應5 h，在65℃條件下保溫10 min終止反應，此液為連接后產物。隨后取 10 μL連接產物，2 μL 10×buffer R，2 μLHaeIII酶（10 U/μL），12 μL 雙蒸水，37℃條件下再次酶切 3 h，酶切后產物加入80 μL TE0.1（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA pH 8），作為預擴增反應的DNA模板。

1.3.2 預擴增 預擴增PCR反應體積為30 μL，含預擴增模板 6 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.45 μL，SSR 錨定引物（10 μM）1.5 μL，MseI引物（10 μM）1.5 μL，10×PCR buffer 3.0 μL，Mg2+（20 mM）3.6 μL，10 mM dNTP 0.9 μL，雙蒸水13.05 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性2 min，25個PCR循環（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）。預擴增產物用TE0.1稀釋10倍后即是選擇性擴增的DNA模板。

1.3.3 選擇性擴增及檢測 選擇性擴增的 PCR反應體積為10 μL，含選擇性擴增模板1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，加尾 SSR 錨定引物（1 μM）0.6 μL，10×PCR buffer 1.0 μL，Mg2+（20 mM）1.2μL，10 mM dNTP 0.3 μL，熒光引物 M13-F（0.1 μM）0.5 μL，MseI選擇性擴增引物0.6 μL，雙蒸水4.65 μL。選擇性擴增的 PCR 程序如下：94 ℃ 30 s、60 ℃（每個循環下降0.7 ℃）30 s、72 ℃ 1 min，循環9次；再按 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 循環25次。擴增產物利用LI-COR 4300 DNA遺傳分析儀（LI-COR Biosciences, USA）進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳掃描檢測。

1.4 數據統計及分析方法

依據熒光掃描圖譜的結果，用“1”（有）和“0”（無）記錄譜帶，把圖形資料轉換成數據資料。利用NTSYS2.0e軟件，以除權配對法（UPGMA）[15]進行SAHN聚類分析和主坐標分析，并計算出樣本間的遺傳相似系數。

2 結 果

2.1 選擇性擴增引物對的篩選與煙草種質材料的MFLP多態性分析

利用 D101、RG17、長脖黃和 C151作材料，分析MFLP選擇性擴增引物組合的擴增效果來確定適宜的引物組合。試驗結果發現，5個加尾SSR錨定引物（fGTCC(GA)6、fCCCA(AG)7、fGGCT(AAG)5、fGACG(AAC)5和fCCAG(CTT)5）分別與 16種MseI選擇性擴增引物組合后擴增出60～700 bp之間熒光強度強弱不一的條帶；但有些引物組合的擴增條帶大多集中在低分子量部分，有的引物組合擴增出的條帶雖多但在4個種質材料間沒有發現多態性。經過比較分析后發現，15對引物組合（表3）的擴增產物在4個種質材料間具有明顯多態斑且清晰易辨，這 15個選擇性引物組合將用于煙草種質材料的MFLP分析。

利用篩選出的選擇性擴增引物組合分析 32份煙草種質，共擴增出1 122個條帶，其中有64個具多態性（表3），多態性占總擴增帶數的5.7%，表明參試資源的遺傳多樣性不是非常明顯。其中每個組合可以得到2～13個清晰易辨的多態性條帶（圖1），表明不同引物組合的擴增效率差異很大。另外，不同來源、類型煙草材料間存在的多態性數目和比例差異相對較大。巴西曬晾煙擴增出 46條多態性帶，多態性比例為4.1%；革雜基擴增出34條多態性帶，多態性比例為 3.0%；其他來源的參試資源的相關數據介于二者之間。這些多態性主要分布在80～400 bp。

表3 篩選出的選擇性擴增引物組合及其擴增片段具有的多態性Table 3 MFLP fragments and polymorphic bands detected from each selective primer combinations

圖1 煙草種質材料的一個MFLP電泳圖Fig.1 An MFLP gel showing polymorphic bands among 32 tobacco varieties.

2.2 煙草種質材料的聚類分析

32份煙草種質兩兩間的相似系數在 0.40到0.83之間，其中D101（美國烤煙）和革新六號（山東烤煙）之間最小，相似系數才0.40，RG17（美國烤煙）和CO139（美國烤煙）之間的相似系數最大，為0.83。根據遺傳相似系數，用非加權組平均法如圖2。從圖中可看出，取相似系數為0.60進行第1等級劃分，可將32份煙草材料分成5大類。C212、NC60和金星均各成一大類。第4大類的平均相似系數約為0.62，它在相似系數約為0.68處又可以分成3小組，第1組包括D101、RG17、長脖黃、C151、CO139、CO176、K149、K326、革雜基和翠碧一號，全部都是烤煙，其中6個來自美國，其他都來自中國，其中RG17和CO139的相似系數最大，種質間的親緣關系最近；第2組包括G28、K358、K399、K730、OX2028、R-158、RG11、RG-22和RG-8均是美國烤煙，其中，K730和OX2028的親緣關系最近；第3組包括CV087和NC95。第5大類的平均相似系數也約為0.62，它在0.68處也可以分成3小組，第1組包括K346和豐字一號，第2組是KY26、巴西曬晾煙和大白筋599，第3組是Atnarello毛晾、革新六號和紅花大金元。

圖2 32份煙草種質材料的基于MFLP多態性數據轉化成遺傳多態性的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram depicting patterns of genetic diversity estimated by MFLP marker alleles among 32 tobacco varieties

從以上的聚類結果來看，大部分來自美國的烤煙品種很好地聚類到了一起，3個白肋煙都包含在第5大類之中，但總體而言并沒有明顯地分辨出白肋煙和烤煙的區別，反而是來自廣東的烤煙C212、美國的烤煙NC60和山東的烤煙金星和其他品種的親緣關系較遠，其遺傳差異性較大。

2.3 依據MFLP標記的32份煙草種質的主坐標分析

對32份煙草種質的MFLP標記的原始矩陣進行主坐標分析，前3個主坐標所能解釋的相關性分別為12.4%、10.6%和8.3%。32份種質的第1和第2主坐標、第1和第3主坐標的二維圖排序如圖3所示。

圖3 依據MFLP標記對煙草種質進行主坐標分析的第1與第2（左）、第1與第3（右）主座標散點圖Fig.3 Principal coordinate map for the first and second (left ), the first and third (right) coordinates estimated for MFLP marker alleles by means of the genetic similarity matrix for 32 tobacco varieties

綜合第1和第2座標及第1和第3座標排序，可將煙草種質材料分成4類11個組。第1類共有3個白肋煙5個烤煙，分成3組；第1組包括KY26、革雜基、大白筋599，第2組包括K346、Atnarello毛晾、巴西曬晾煙，第3組為翠碧一號和豐字一號。第2類的9個烤煙可分成3組，第1組包括D101、CO139、CO176、K326、長脖黃和C151，第2組為RG17和RG-22，第3組為K149。第3類的9個烤煙材料亦分成3組，其中第1組為CV087和NC95，第2組為K399，第3組全來自美國的烤煙，包括G28、K730、NC60、OX2028、RG11、RG-8。第 4類則分成2組，第1組為K358，第2組包括C212、R-158、革新六號、紅花大金元和金星。

主坐標分析能從不同方向、不同層面更加直觀地顯示各品種間的關系，可進行更加細致精確的歸類。在以往的親緣關系研究中，多采用系統聚類法，這對于反映親緣關系很近的種質之間的關系來說很有效，但對于親緣關系較遠的種質之間的聚類，卻顯得信息量不足。因此，將系統聚類分析和主坐標分析結合起來使用，相互補充、驗證，能為闡明煙草種質之間的親緣關系提供更全面的信息[16]。

3 討 論

3.1 熒光標記技術

Yang等[1]建立的MFLP分析技術采用放射性同位素進行標記，但存在著一系列令人困擾的問題，如成本高、探針半衰期短、放射性物質危害人體健康等；另外還需要有專門的實驗室、相應的實驗保護設施和專業人員，因而限制了在普通實驗室開展研究工作，而采用熒光標記技術則不存在上述問題。因此，本研究通過將M13通用熒光接頭連接在設計的SSR引物上，對操作者而言安全系數高。另外，與國內較常用的銀染相比，熒光標記的效率明顯高于銀染，能得到更多更全的基因組變異信息，所花時間也短，而且從總體上而言，在不討論設備成本的前提下，熒光標記的總成本會低于銀染[17]。

3.2 煙草品種的遺傳多樣性

根據本試驗聚類分析和主坐標分析結果，難以完全確定來自不同國家和地區的煙草品種材料，只是當類分得很細時可將一部分美國烤煙品種單獨組成一組（主坐標分析中第3類的第3組），這表明供試煙草品種的地理來源與遺傳差異之間并沒有必然的聯系，當然也有一部分原因是國內許多品種來源于美國品種，因此親緣關系較近。3個白肋煙品種也沒有與其他烤煙品種表現出很明顯的區別，只是表現出三者之間的親緣關系相對較近，且均聚集在一個大類中（聚類分析中均在第 5大類中），在一定程度上預示了兩大品種間應該還是存在一定的差異。本研究從分子水平上一定程度地印證了目前我國煙草品種資源的匱乏，且實驗結果與肖炳光等[18]的報道類似，均未體現出地域性差異對聚類結果有明顯的影響。因此，在今后的煙草育種中應該更多地考慮被聚集在不同類中的煙草資源，而不是單純地考慮其來源地。

3.3 MFLP分子標記在煙草遺傳分析中的應用分析

但迄今為止，煙草上運用較多且較為成熟的分子標記技術還是RAPD標記，其他標記類型則運用較少；而RAPD標記最大的缺點是引物為單鏈且短，對反應條件較為敏感，重復性差[19]。簡單序列重復區間擴增多態性（ISSR）擴增產物的重復性和穩定性亦不很理想，擴增效果類似于或略高于RAPD[20]；AFLP技術的重現性和穩定性較高，多態性豐富，適合于作物的遺傳分析[8,21-22]，但它與RAPD、ISSR等標記一樣，擴增產物基本上都具有多個位點的顯性標記，并且難以將其中感興趣的位點轉換成序列特異性且操作簡便的PCR標記[1,22]。SSR標記操作簡便，穩定性、重現性好，共顯性、序列特異性強，但煙草中發現SSR的數量仍限于Bindler等[10]開發的282個煙草的SSR標記，明顯難以滿足開展煙草研究和應用的需要。而MFLP技術最大的優點是結合了SSR和AFLP標記的優點，具有多態性豐富、重復性和穩定性好、且有高比例共顯性等優點，并且很容易將具多態性的MFLP片段轉換成序列特異性且操作簡單的PCR標記（主要是SSR標記）[1,3]；這樣運用MFLP技術開展煙草遺傳分析的同時，還可開發具有多態性的煙草SSR標記。因此，本實驗熒光MFLP技術在煙草遺傳分析成功應用，不僅能為煙草種質材料的分類提供更多依據，還可為開發出煙草的序列特異性PCR標記、促進煙草DNA分子標記技術的發展奠定基礎。

4 結 論

在 Yang等 2001年建立的利用放射性同位素MFLP分子標記技術的基礎上，我們建立了適合于煙草的熒光MFLP分子標記技術體系。利用此體系檢測了32份煙草種質材料的MFLP多態性，所得的煙草MFLP熒光圖譜的條帶清晰易辨且多態性豐富，結合聚類分析能有效地將這些煙草種質材料的來源和類型進行分類，表明熒光MFLP技術可較好地用于開展煙草遺傳特性分析的研究和應用工作。

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