超高效液相色譜法測定煙葉中的茄尼醇含量

張 婕，汪云松，蔡 凱，向章敏，周淑平，許冬青，耿召良*

（1.貴州省煙草科學研究所，貴陽 550081；2.云南大學，昆明 650091）

茄尼醇（C45H74O）是一種主要存在于茄科植物葉中的無環四倍半萜烯醇化合物，于 1956年首次從烤煙中分離出來，在煙草葉片中的含量最高[1-2]。茄尼醇是藥物合成的重要原料和泛醌類藥物的關鍵中間體，具有重要的醫藥開發價值[1-4]。同時，茄尼醇在卷煙燃吸過程中可以熱解產生多種香氣成分和多環芳烴等有害物質，對煙草制品的品質和安全性具有很大影響[5]。煙葉中的茄尼醇測定方法主要有薄層掃描法、氣相色譜法、液相色譜法和庫侖滴定法，其中液相色譜法具有操作簡單、定量準確、重復性好等優點，是測定茄尼醇含量應用較多的一種方法[6-9]。普通高效液相色譜分析時間長，多使用乙腈、甲醇、乙醇等2種以上的洗脫劑作為流動相，其與萃取液（丙酮、甲醇等有機溶劑）組成的差異，會對色譜峰形造成影響，降低準確性[7-15]。針對普通液相色譜檢測煙葉茄尼醇含量的不足，本研究采用分析速度更快、流動相用量更省的超高效液相色譜（UPLC）對煙葉中的茄尼醇進行分析，對流動相組成等分析條件進行優化，將煙草樣品用甲醇溶液萃取過濾后，直接進行超高效液相色譜分離測定，并通過比較標樣和樣品質譜圖的方式對是否有共流出的干擾峰進行了檢測，最終建立煙葉中游離茄尼醇含量的快速分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（美國Waters公司，ACQUITY UPLC H-CLASS）；超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜（美國 Waters公司，UPLC-XEVO Q-TOF）；電子天平（瑞士Merrier Toledo公司，AB104-S，波振蕩器（德國Elma公司，T701DH）；KS多用調速搖床振蕩器（北京科偉科技儀器有限公司）；超純水系統（美國Millipore公司，Milli-Q Element）；尼龍針式濾頭（天津市津騰實驗設備有限公司，0.22 μm）乙腈、甲醇、異丙醇（美國默克公司，色譜純）；丙酮（上海申博化工有限公司，分析純）、無水乙醇（上海振興化工一廠，分析純）；茄尼醇對照品（廣州百靈威科技有限公司，純度90%）。

1.2 樣品制備

共 11個煙葉樣品，其中烤煙和晾曬煙煙葉樣品采集于貴州省某產區，香料煙采自云南保山。研磨至粉末，過60目篩，稱取50 mg（精確至0.1 mg）樣品于50 mL離心管中，準確加25 mL甲醇溶液在超聲波頻率40 KHz，萃取功率130 W條件下萃取10 min，取2 mL萃取液，經0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：BEH C18 （1.7 μm，2.1 mm×50 mm），美國Waters公司；流速為0.4 mL/ min；柱溫為30℃；進樣量為2 μL；運行時間5 min。

流動相：100%甲醇等度洗脫。

1.4 質譜條件

大氣壓化學電離源（APCI），正離子模式檢測，電暈電流4 μA，電暈針溫度500 ℃，采樣錐孔電壓30 V，提取錐孔電壓4 V，源溫120 ℃，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/Hr。

采用 MS模式，全掃描質荷比（m/z）范圍為100～1000，掃描時間 5 min。

1.5 標準溶液的配制及定量

準確稱取8.5 mg茄尼醇對照品，用甲醇溶解定容至50 mL，得濃度為153.00 μg/mL的標準儲備液，冷藏于4 ℃備用。

分別取茄尼醇標準儲備液，用甲醇稀釋配制成濃度為0.765，1.530，3.825，7.650，15.30，30.60，76.50 μg/mL的系列標準溶液。

采用比較標準與樣品質譜圖、保留時間定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 線性范圍及檢出限

采用1.5配制的系列標準溶液進行液相色譜分析，對峰面積（Y）與濃度（X，μg/mL）進行線性回歸，得茄尼醇的回歸方程。結果表明，該方法在0.765～76.5 μg/mL濃度范圍內有良好的線性關系（Y= 2110X+ 4120，r2= 0.9992）。以信噪比為3計算，茄尼醇的檢測限為7.65 ng/mL，遠低于實際煙草樣品中茄尼醇含量，說明本方法的靈敏度較高。

2.2 回收率和重復性

稱取50 mg相同烤煙粉末樣品10份，分成2組，一組5份。其中一組按照1.3、1.4的實驗條件平行測定5次，計算方法的重復性，另外一組樣品分別加入0.68 mg的茄尼醇對照品，根據標樣加入量、加標前后樣品的測定量計算回收率。結果表明，茄尼醇的精密度測定 RSD為 2.62%，回收率為91.1%，說明本方法的準確性較高，重復性較好。

2.3 穩定性實驗

取同批次供試品溶液，按上述測定方法在0、1、4、8、12、24 h分別測定1次，測得茄尼醇峰面積的RSD為0.6%，表明提取樣品溶液在24 h內穩定性好。

2.4 最佳操作條件的選擇

2.4.1 流動相及檢測波長選擇 考慮到茄尼醇的低極性，在反相色譜柱上分別考察了以不同比例的乙腈-異丙醇、乙腈、甲醇作為流動相時茄尼醇的分離情況。結果表明，茄尼醇在乙腈:異丙醇體積比為83:17和100%甲醇作為流動相的時候都得到了良好的色譜分離。與乙腈-異丙醇流動相比較，甲醇作為流動相不僅信噪比高、分離時間短，且甲醇毒性較低，因此選擇 100%甲醇作為流動相。經全波長掃描，知茄尼醇最佳吸收波長在200 nm左右。實驗選取波長范圍為199～213 nm、間隔2 nm的多通道檢測方式，比較茄尼醇在不同檢測波長下的吸光度值，同時比較各波長條件下的基線噪音干擾因素。結果表明，207 nm為茄尼醇最佳的檢測波長。

2.4.2 流速及柱溫選擇 比較了流速分別為 0.2，0.4，0.6 mL/min時茄尼醇的出峰分離情況。綜合考慮流速和柱壓對檢測物質峰形和色譜柱壽命的影響，確定選擇檢測流速為0.4 mL/min，此時茄尼醇的色譜保留時間為2.49 min，柱壓正常。在該流速下每個樣品在5 min內即可完成色譜分離。考察色譜柱在 23、30、35、40 ℃柱溫條件下樣品的分離情況。結果表明，溫度對茄尼醇色譜分離的影響較小，確定最佳的柱溫條件為30 ℃。

2.4.3 共流出物干擾峰檢測 實驗采用純甲醇進行提取前處理和進行色譜分離，使極性很弱的茄尼醇在2.49 min即洗脫下來，但這樣強的洗脫能力同樣可能會使樣品中的其他物質的出峰時間縮短，可能導致與茄尼醇性質類似的非極性物質與茄尼醇共流出，從而對茄尼醇的測定造成干擾。為排除這種可能性，采用定性能力強的四級桿串聯飛行時間質譜（Q-TOF）對茄尼醇標準品和樣品進行了對比分析。

在大氣壓化學電離源（APCI），正離子模式下，采用茄尼醇標準品不經液相色譜柱分離，直接進樣的方式，使用TOF MS對茄尼醇的質譜分析條件進行了優化，結果表明在1.4的質譜條件下茄尼醇響應最高。實驗采用1.3和1.4的分析條件分別對茄尼醇標準品和煙葉樣品進行分析，由二者扣除各自基線背景的質譜圖（圖 1）看出，二者質譜圖的特征離子峰一致，都是以m/z為613.57的離子峰為基峰，另外還存在豐度較低的m/z為631.58的離子峰。

采用 MassLynx 4.1質譜軟件對分子式進行推測，得知m/z為613.57的離子峰的分子式為C45H73，是茄尼醇（C45H74O）失去一個H2O分子的加氫離子峰（[M-H2O+H]+離子），m/z為631.58的分子式為C45H75O，是茄尼醇分子的加氫離子峰（[M+H]+離子）。由此可知，在APCI正離子分析模式下，茄尼醇的羥基不穩定，大部分極易失水脫去而形成脫水加氫離子峰，僅一小部分形成加氫離子峰。由此確定采用1.3的色譜條件可以使樣品中的茄尼醇完全從基質中分離出來，未受到共流出雜質的干擾，分離效果良好。

圖1 茄尼醇標樣和煙樣質譜圖Fig.1 APCI-TOF MS spectra of solanesol of standard sample and tobacco sample

2.5 前處理條件優化

2.5.1 提取溶劑的選擇 實驗選取甲醇、乙醇、丙酮3種萃取溶劑，根據1.2的樣品制備方法，稱取同一烤煙樣品9份，分成3組，分別加入25 mL甲醇、乙醇、丙酮進行提取。結果表明，使用乙醇、丙酮作為萃取溶劑時，其提取液在茄尼醇出峰位置都存在另一化合物的干擾峰（圖2），嚴重干擾茄尼醇的定性和定量檢測。為進一步驗證干擾物質是否來自提取溶劑的差異，改用異丙醇：乙腈體積比為17:83的有機試劑作為流動相，對上述甲醇、乙醇、丙酮處理后的樣品進行色譜分離，分析結果類似于圖2。因此，選取甲醇作為最佳提取溶劑。

圖2 萃取溶劑分別為甲醇、乙醇、丙酮的茄尼醇色譜圖Fig.2 Chromatogram of solanesol using methanol, alcohol,acetonie as extracting solvent respectively

2.5.2 超聲提取時間選擇 根據1.2的樣品制備方法，稱取同一烤煙樣品8份，分為4組，按1.2的超聲萃取條件，分別考察了超聲時間為 5，10，20和30 min時茄尼醇的提取情況。結果發現，萃取5，10，20和30 min茄尼醇含量分別為11.50、12.64、12.48、12.22 μg/g，此說明當提取時間為10 min時，提取液已達到溶解平衡。因此，確定超聲提取時間為10 min。

2.6 煙草樣品中茄尼醇分析

采用比較標準與樣品質譜圖、保留時間定性，外標法定量，分別對不同的烤煙、晾曬煙、香料煙樣品進行了檢測分析，結果見表1。

表1 3種不同類型煙草中茄尼醇含量Table 1 The contents of solanesol in the extract of 3 different tobacco leaves

3 結 論

反相高效液相色譜法是檢測煙葉茄尼醇含量的主要手段，但實際操作中依然存在分析時間長、流動相用量大，前處理復雜、流動相與萃取溶劑存在差異影響定量等問題。本研究優化了樣品前處理，對樣品檢測條件進行了比較分析，采用四級桿串聯飛行時間質譜（Q-TOF）對共流出物的干擾峰進行了排除，建立了將煙葉樣品用甲醇萃取后直接使用UPLC進行分析的快速檢測方法。該方法簡便快速、結果準確，適用于煙葉中游離茄尼醇含量的快速批量分析。

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