葡萄糖和谷氨酰胺濃度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

張淑香 陳彥田 齊念民

葡萄糖和谷氨酰胺濃度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

張淑香 陳彥田 齊念民

目的 探索葡萄糖和谷氨酰胺濃度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）體外培養(yǎng)的影響。方法 分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。采用不同濃度葡萄糖和谷氨酰胺對hUC-MSCs進行體外培養(yǎng)，結(jié)晶紫計數(shù)法記錄細(xì)胞增殖曲線，并檢測培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果 傳代的hUC-MSCs均一地高表達CD29、CD44、CD105和CD90，不表達CD14、CD45。葡萄糖濃度增加，會促進細(xì)胞的增殖，對葡萄糖消耗、乳酸生成和谷氨酰胺消耗沒有影響，但增加了氨的生成；谷氨酰胺濃度增加，對細(xì)胞增殖的促進作用有限，但可提高細(xì)胞的生長速率，從而縮短培養(yǎng)時間，對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗影響不大，但增加了乳酸和氨的生成。結(jié)論 葡萄糖和谷氨酰胺都可促進細(xì)胞的增殖。葡萄糖缺失時其他氨基酸充當(dāng)?shù)?，谷氨酰胺充足時谷氨酰胺轉(zhuǎn)化成乳酸的通量增大。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 葡萄糖 谷氨酰胺 生長 代謝

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，目前可作為組織工程的種子細(xì)胞來修復(fù)各種病變和缺損組織。應(yīng)用于創(chuàng)傷性疾病、燒傷及心肌疾患等疾病的治療中[1-2]。用于臨床應(yīng)用研究的MSCs主要為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord-derived MSCs，UCMSCs）。相對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived MSCs，BM-MSCs），UC-MSCs 因含量豐富、增殖潛能高、免疫原性低、支持造血功能強、取材方便，為細(xì)胞治療和組織工程提供了良好的種子細(xì)胞來源[3]，進一步提高其增殖、分化能力，以提供臨床組織構(gòu)建所需的細(xì)胞數(shù)量，是迫切需要解決的問題。

細(xì)胞培養(yǎng)中葡萄糖和谷氨酰胺是主要的營養(yǎng)物質(zhì)，充當(dāng)碳源、氮源和能源。乳酸和氨是代謝副產(chǎn)物。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的缺失和有毒代謝產(chǎn)物的累積是限制細(xì)胞生長的主要因素[4-6]。為此，我們通過葡萄糖和谷氨酰胺濃度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human UC-MSCs，hUC-MSCs）生長代謝的影響，考察細(xì)胞的生長代謝特性，為快速獲得大量種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰酶-EDTA混合液、α-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）；10%胎牛血清（Hyclone公司）；培養(yǎng)皿（Falcon公司）。

血清計數(shù)板（Hausser Scientific公司）；濃度檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；流式細(xì)胞儀（BD 公司）；光學(xué)顯微鏡（Nikon公司）。

1.2 hUCMSCs的傳代培養(yǎng)與鑒定

由江蘇省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供健康產(chǎn)婦正常足月新生兒臍帶（產(chǎn)婦知情同意），4℃保存，6 h內(nèi)處理。具體分離及原代培養(yǎng)方法參照文獻。

將凍存的第1代hUC-MSCs經(jīng)37℃水浴槽融化后快速移到培養(yǎng)皿中，12 h后完全換液，3～4 d后胰酶-EDTA混合液消化，按1:3或者1:4傳代。細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇10代以內(nèi)的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。待細(xì)胞融合率達80%時，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；同時取2×106個細(xì)胞針對干細(xì)胞表面抗原進行流式細(xì)胞儀檢測鑒定。

1.3 葡萄糖和谷氨酰胺濃度實驗

起始培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為5.56 mmol/L和2 mmol/L，接種密度為5 000 cells/cm2。①葡萄糖濃度的實驗：24 h時培養(yǎng)液分別換成含不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基，使得葡萄糖終濃度分別5.56 mmol/L、11.12 mmol/L和22.24 mmol/L；②谷氨酰胺濃度的實驗：24 h時培養(yǎng)液分別換成含不同谷氨酰胺濃度的培養(yǎng)基，使得谷氨酰胺終濃度分別為2 mmol/L、2.5 mmol/L、3 mmol/L 和 4 mmol/L。

1.4 主要觀察指標(biāo)

①細(xì)胞計數(shù)：胰酶-EDTA混合液消化后的細(xì)胞懸液，用血清計數(shù)板檢測細(xì)胞密度；②上清液離心后用試劑盒檢測葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的濃度。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的鑒定

光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，傳代的hUC-MSCs呈梭形或多角形，少數(shù)呈圓形；當(dāng)達到80%～90%融合時，細(xì)胞大小均勻，有規(guī)則地平行排列或旋渦狀排列，呈克隆樣生長（圖1）。

圖1 第7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察（光學(xué)顯微鏡，40×）Fig.1 Histological observation of hUC-MSCs of P7(light microscope,40×)

流式細(xì)胞儀檢測表面抗原顯示：細(xì)胞均一性高表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44和CD105，表達干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90，不表達造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD14、CD45。表明第7代hUC-MSCs仍保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物特征，與文獻報道的結(jié)果類似[7]。

2.2 葡萄糖對hUC-MSCs生長代謝的影響

濃度實驗結(jié)果顯示：葡萄糖濃度增加，細(xì)胞密度增加。說明葡萄糖會促進細(xì)胞的增殖，張芳等[8]和Li等[9]在人間充質(zhì)干細(xì)胞的研究中也有類似報道。葡萄糖濃度低，造成培養(yǎng)后期葡萄糖耗盡，但乳酸濃度沒有下降，說明乳酸沒有被消耗；而谷氨酰胺消耗沒有變化，氨濃度增加，YAmm/Glun較高。在葡萄糖濃度低的培養(yǎng)液中葡萄糖和谷氨酰胺代謝速率較高，但YLac/Gluc較低，這與轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中葡萄糖代謝有所不同[10－11]（圖2、表1）。

2.3 谷氨酰胺對hUC-MSCs生長代謝的影響

濃度實驗結(jié)果顯示：谷氨酰胺濃度增加，細(xì)胞密度增加，但增加的幅度相對較小；谷氨酰胺濃度繼續(xù)增加，會使細(xì)胞生長曲線前移，提高細(xì)胞生長速率。谷氨酰胺濃度增加對葡萄糖的代謝速率影響不大，但使得YLac/Gluc隨之增加；對谷氨酰胺的代謝速率和代謝系數(shù)影響不大（圖3、表2）。

圖2 葡萄糖濃度對hUC-MSCs生長代謝的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on the growth and metabolism of hUC-MSCs

圖3 谷氨酰胺濃度對hUC-MSCs增殖代謝的影響Fig.3 Effect of glutamine concentration on the proliferation and metabolism of hUC-MSCs

表1 葡萄糖濃度對hUC-MSCs生長代謝的影響Table 1 Effect of glucose concentration on the growth andmetabolism of hUC-MSCs

表2 谷氨酰胺濃度對hUC-MSCs生長代謝的影響Table 2 Effect of glutamine concentration on the growth and metabolism of hUC-MSCs

3 討論

形態(tài)觀察和流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明本實驗所用的hUC-MSCs保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

5.56 mmol/L組中細(xì)胞因葡萄糖耗盡而停止增殖，而22.24 mmol/L組中達到最大細(xì)胞密度時，葡萄糖和谷氨酰胺沒有耗盡，乳酸和氨的濃度分別為4.0 mmol/L和0.81 mmol/L，還沒有達到抑制的濃度，文獻報道5 mmol/L的乳酸對細(xì)胞擴增沒有明顯的抑制作用[5]，這說明培養(yǎng)液中有未檢測的營養(yǎng)成分耗盡或者抑制因素存在，導(dǎo)致細(xì)胞生長停止。從而給出一個信息，單純地優(yōu)化某個培養(yǎng)液成分或者組合，可能無法有效地提高細(xì)胞密度，或許把培養(yǎng)液作為“個體”來優(yōu)化，是提高細(xì)胞密度的途徑之一。

在達到最大細(xì)胞密度時除了2 mmol/L組葡萄糖耗盡之外，其他組都維持了較高的葡萄糖和谷氨酰胺濃度，乳酸濃度都低于5 mmol/L，氨濃度在1.0 mmol/L左右。因此，1.0 mmol/L的氨濃度可能會抑制細(xì)胞的增殖，或者有未知的營養(yǎng)成分缺失及抑制成分生成致細(xì)胞停止生長。本實驗中，2.5 mmol/L組的氨生成最少，從而獲得的細(xì)胞密度最大。另外，本實驗結(jié)果提示，培養(yǎng)后期谷氨酰胺濃度對細(xì)胞密度的維持起著重要的作用。

葡萄糖濃度的實驗結(jié)果說明，葡萄糖發(fā)生缺失時，氨基酸等消耗增加，為hUC-MSCs生長提供能量，從而造成氨生成增加。谷氨酰胺濃度的實驗結(jié)果說明，谷氨酰胺濃度增加，即葡萄糖與谷氨酰胺的比例減少，增加了谷氨酰胺向乳酸的生成，相應(yīng)地減少了谷氨酰胺向氨的生成；而谷氨酰胺濃度增加使得與谷氨酰胺代謝有關(guān)的其他氨基酸代謝也增加，增加了氨的生成，平衡了流向乳酸的谷氨酰胺的比例?？傊劝滨０窛舛仍黾?，會促進細(xì)胞的生長，但濃度不宜過高，避免過多乳酸和氨生成。

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Effects of Various Concentrations of Glucose and Glutamine on the Cultivation of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells in Vitro

ZHANG Shuxiang,CHEN Yantian,QI Nianmin.School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China.

CHEN Yantian(E-mail:ytchen@sjtu.edu.cn).

ObjectiveTo explore the effects of various concentrations of glucose and glutamine on the cultivation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)in vitro.MethodsThe hUC-MSCs were separated and cultured.The morphology and surface antigens were investigated by optical microscopy and flow cytometry.Then hUC-MSCs were cultured with various concentrations of glucose and glutamine in vitro.Cells on microcarriers were counted by crystal violet staining.The nutrients and their by-products in the medium supernatant were measured.ResultsThe markers of CD29,CD44,CD105,and CD90 were strongly expressed in hUC-MSCs,but the markers of CD14 and CD45 were not.With the increase of glucose concentration,the expansion of cells increased,glucose consumption,lactate formation and glutamine consumption had no change,and the ammonium formation improved.The increase of glutamine concentration had a limited effects to improving cell proliferation,but it shorted the culture period as improving growth rate.The increase of glutamine concentration had no effect on the consumption of glucose and glutamine,but improved the formation of lactate and ammonium.ConclusionGlucose and glutamine both enhanced cell proliferation.Lack of glucose results in the larger consumption of amino acids to provide nitrogen,and large supply of glutamine leads to the larger formation of lactate from glutamine.

Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells;Glucose;Glutamine;Growth;Metabolism

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）04－0185－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.002

中國博士后基金面上項目（2011M500780）。

200240 上海市 上海交通大學(xué)藥學(xué)院。

陳彥田（E-mail：ytchen@sjtu.edu.cn）。

2012年6月19日；

2012年7月10日）