ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮膚成纖維細胞中的表達及意義

宋仁剛

ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮膚成纖維細胞中的表達及意義

宋仁剛

目的 體外研究鼠尾皮膚成纖維細胞（MTSF）發生老化時，ANGPTL－1中的表達及意義。方法 分別收集不同年齡原代鼠尾皮膚成纖維細胞，并檢測老化細胞的COL1、COL3及透明質酸合成量。用RT-PCR檢測兩組細胞中ANGPTL－1基因及膠原蛋白與透明質酸含量。結果 ANGPTL－1基因在青年組鼠尾皮膚成纖維細胞中的表達明顯高于老年組（P＜0.01）；老年組成纖維細胞COL1、COL3及透明質酸合成量顯著低于青年組成纖維細胞（P<0.01）。結論ANGPTL－1基因可能是延緩鼠尾皮膚成纖維細胞老化的重要基因之一，可應用于皮膚抗衰老的研究。

血管生成素樣蛋白 老化 皮膚成纖維細胞 膠原蛋白 透明質酸（HA）

皮膚組織會不可避免的出現老齡化變化。臨床表現為皮膚失水，皺紋增加，皮膚松弛，彈性下降；組織學上表現為皮膚膠原纖維和彈性纖維斷裂，透明質酸（hyaluronic acid，HA）含量減少。皮膚膠原蛋白及透明質酸由真皮層內的成纖維細胞的合成[1]。因此，探索皮膚衰老的相關因素，篩選相關基因，有望成為對抗皮膚老化的又一途徑。

通過網絡對基因數據庫的搜索，我們篩選了出了血管生成素樣蛋白（ANGPTL）-1基因。在老年組小鼠與青年組小鼠中，ANGPTL-1基因的表達存在顯著性差異（P<0.01），而關于ANGPTL1基因與皮膚老化關系，目前仍缺乏相關研究報道。

1 材料和方法

1.1 成纖維細胞收集

分別選取5月齡和 30月齡的小鼠各10只，分別記為青年組與老年組。標本取自鼠尾的皮膚。收集皮膚標本，以0.25%DispaseⅡ于4℃下消化8～11 h，用眼科鑷子掀去表皮，保留真皮組織，用PBS清洗3次，剪碎，加入0.1%復合膠原酶，37℃消化4 h，100目無過濾，收集濾液，離心 10 min（1 000 r/min），去上清，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM重懸。備用。

1.2 RT-PCR檢測

收集青年小鼠與老年小鼠尾部皮膚成纖維細胞，提取總RNA時根據指示使用TRIzol試劑盒（Invitrogen公司）。以MQ水作為空白對照，分別記錄RNA濃度及A260 nm/A280 nm。用反轉錄酶（TaKaRa公司）分離RNA，轉化為cDNA。目的基因在Pubmed中得到序列號，通過使用軟件Primer Premier 5.0 設計 ANGPTL-1、COL1、COL3 和內參GAPDH的引物。然后使用PCR擴增的Taq酶試劑盒（TaKaRa公司）及引物（由生工合成）加至 25 μL體積進行反應。

1.3 ELISA分析測量透明質酸

收集各組分第7天的培養液進行COL1、COL3和HA的ELISA檢測，ELISA試劑盒（R&D systems公司）。按說明書加標準品，繪制標準曲線。將陰性、陽性對照組和待檢測樣品，按設計孔位加入96孔板，100 μL/孔。按說明書操作，除空白組外均加入50 μL的檢測緩沖液。混勻，37℃恒溫孵育30 min。孵育之后棄液，用緩沖液沖洗4次，每孔加100 μL的有效酶。混勻后，加蓋，37℃孵育30 min。然后，用沖洗緩沖液將檢測板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。避光室溫孵育5 min，加入50 μL的反應終止溶液終止反應。15 min內，在405 nm波長下觀察吸光率，測出HA的濃度。

1.4 統計分析

用SPSS 11.0統計軟件，進行t檢驗，P<0.01被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡數據庫中信息搜索結果

在青年組（n=10）小鼠皮膚細胞中，ANGPTL基因表達明顯高于老年組（n=10）（P<0.01）（圖1）。

圖1 網絡數據庫中信息搜索結果Fig.1 The research results in net data base

2.2 RT-PCR檢測

圖2 RT-PCR檢測Fig.2RT-PCR

如圖2所示，1泳道為青年組小鼠 HA基因表達，2、6泳道為Marker，3泳道為青年組COL1表達，4泳道為老年組COL1表達，5泳道為老年組HA基因表達，7泳道為青年組COL3表達，8泳道為老年組COL3表達，9泳道為青年組ANGPTL－1基因表達，10泳道為老年組ANGPTL1基因表達。

RT-PCR結果顯示，隨著小鼠年齡的增加ANGPTL基因的表達逐漸降低。

2.3 透明質酸ELISA測量

培養至第7天的成纖維細胞培養液分析發現，伴隨小鼠年齡的降低細胞合成的Ⅰ、Ⅲ型膠原（COL1、COL3）與 HA 量均有增加的趨勢（P<0.05）。ELISA測定透明質酸功能變化結果顯示，其合成的膠原和透明質酸量也伴隨ANGPTL－l基因的表達的降低而顯著降低，并呈現出明顯的相關性（圖3）。

圖3 ELISA測量Fig.3 ELISA

3 討論

血管生成素樣蛋白（ANGPTL）-1是血管生成素相關蛋白家族的成員，具有調制血管生成的作用。

透明質酸與膠原蛋白是人體真皮組織中的重要組成部分，隨著紫外線的不斷照射以及人年齡的增加，皮膚內透明質酸與膠原蛋白的含量逐漸減低，真皮組織被氧化、皮膚塌陷、萎縮。皮膚在外觀上表現為粗糙、干燥、皺紋增大、松弛等一系列衰老征象。

近年來，在關于皮膚發生老化的研究中，皮膚成纖維細胞已經成為研究重點[2]，研究內容包括老化時細胞的基因[3-4]，受體改變[5]，相關信號傳導通路的變化等領域[6-7]。

RT-PCR結果顯示，隨著小鼠年齡的增加ANGPTL－l基因的表達逐漸降低。ELISA測定透明質酸功能變化結果顯示，其合成的膠原和透明質酸量也伴隨ANGPTL基因的表達的降低而顯著降低，并呈現出明顯的相關性。

本實驗結果提示，ANGPTL-1基因可能是延緩鼠尾皮膚成纖維細胞老化的重要基因之一，可應用于皮膚抗衰老的研究。然而，ANGPTL-1基因通過何種機制參與皮膚老化的調控，尚需進行深入研究。

[1]Rock K,Grandoch M,Majora M,et al Collagen fragments inhibit hyaluronan synthesis in skin fibroblasts in response to ultraviolet B(UVB):new insights into mechanisms of matrix remodeling[J].J Biol Chem,2011,286(20):18268-18276.

[2]王繼華,劉垠,何永靜,等.TGF-β1對UVA照射皮膚成纖維細胞Ⅰ型 Ⅲ型膠原合成和表達的影響[J].中國美容醫學,2009,18,(3):338-341.

[3]Ohno T,Hirano S,Rousseau B.Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2009,118(10):735-741.

[4]劉垠,劉流,王繼華,等.長波紫外線照射皮膚成纖維細胞表皮生長因子受體的表達[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(11):1965-1968.

[5]Sukonina V,Lookene A,Olivecrona T,et al.Angiopoietin-like protein 4 converts lipoprotein lipase to inactive monomers and modulates lipase activity in adipose tissue[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(46):17450-17455.

[6]Robinson CJ.Growth factors:therapeutic advances in wound healing[J].Ann Med,1993,25:535-538.

[7]Lai DM,Li H,Lee CC,et al.Angiopoietin-like protein 1 decreases blood brain barrier damage and edema following focal cerebral is chemia in mice[J].Neurochem Int,2008,52(3):470-477.

The Expression and Meaning of ANGPTL1 Gene in Skin Fibroblast of Aging Mouse Tail

SONG Rengang.Department of Plastic Surgery,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China.

ObjectiveTo explore the expression of ANGPTL－1 gene,collagen and hyaluronic acid(HA)in skin fibroblast of aging mouse tail in vitro.MethodsPrimary mouse skin fibroblasts were collected in young and old mouse group.RTPCR was used to measure expression of collagen and hyaluronic acid.ResultsRT-PCR assay showed that the express of ANGPTL1 is higher in young group than in loder group.There was significant differene between 2 groups (P<0.01).ConclusionANGPTL－1 may be used as an effective factor to delay skin aging.

ANGPTL－1;Aging;Fibroblast;Collagen;Hyaluronic acid(HA)

Q786

A

1673－0364（2012）05－0269－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.006

518020 廣東省深圳市 深圳市人民醫院整形外科。

2012年8月12日；

2012年9月20日）