玉米原料超高濃度酒精發(fā)酵

許宏賢，段鋼

(杰能科(中國(guó))生物工程有限公司亞太谷物加工酶應(yīng)用中心，江蘇無錫，214028)

由于石油危機(jī)而造成的國(guó)家能源安全、農(nóng)民收入和環(huán)境等問題而使得生物酒精的生產(chǎn)日益受到重視，近幾年發(fā)展較快，中國(guó)已成為世界上第三大生物酒精生產(chǎn)國(guó)。現(xiàn)在工業(yè)上的生物酒精絕大部分屬第一代燃料乙醇，即用淀粉質(zhì)原料來生產(chǎn)［1］。據(jù)釀酒協(xié)會(huì)酒精分會(huì)的統(tǒng)計(jì)，2004年我國(guó)酒精生產(chǎn)玉米原料占50.3%，經(jīng)過近幾年的發(fā)展，玉米現(xiàn)在已經(jīng)占到65%［2］。適度發(fā)展玉米燃料乙醇有益于糧食供需平衡，依然可以起到玉米供需平衡蓄水池的作用。同時(shí)玉米也是深加工鏈條最長(zhǎng)、產(chǎn)品系列最豐富的糧食品種［3］，因此相對(duì)于其他淀粉質(zhì)原料，玉米酒精發(fā)酵的研究意義更大。

高濃度酒精發(fā)酵工藝具有高發(fā)酵率、高轉(zhuǎn)化率、低殘?zhí)呛凸?jié)約能源等特點(diǎn)，可大幅度增加產(chǎn)量，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益［3－4］。據(jù)哈爾濱中國(guó)釀酒有限公司的生產(chǎn)實(shí)踐表明，按年產(chǎn)6萬t酒精計(jì)算，實(shí)施濃醪發(fā)酵后年節(jié)約一次水12萬t，噸酒精節(jié)電62.5°，噸酒精節(jié)約煤160 kg，年節(jié)約資金675萬元，減排廢水15萬t［5］。因此，酒精濃醪發(fā)酵是發(fā)酵酒精工藝的重大技術(shù)進(jìn)步，已經(jīng)成為酒精行業(yè)清潔生產(chǎn)重點(diǎn)推廣的技術(shù)之一。

中國(guó)開展生料釀酒研究始于20世紀(jì)70年代。以節(jié)能、減排、高出酒率、高濃度發(fā)酵為特點(diǎn)的無蒸煮生料發(fā)酵工藝是燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)的未來發(fā)展方向［1］。近期的研究增多［6－12］，商業(yè)化過程進(jìn)展也加快［10］。但相對(duì)而言，生料超高濃度酒精發(fā)酵的研究并不多［11－12］。

若采取傳統(tǒng)的蒸煮工藝進(jìn)行超高濃度酒精發(fā)酵，由于黏度問題，在配料濃度很高的情況下，會(huì)造成液化非常不徹底，并且濃醪的換熱和輸送在工廠會(huì)變得異常困難，同時(shí)也影響發(fā)酵體系的傳質(zhì)，而使過程效率降低［7－8］;即便不考慮黏度問題，在這種條件下往往需要特別的耐高糖度、耐高酒度的酵母［13－15］。

生料工藝除了可以節(jié)約能量外，由于整個(gè)系統(tǒng)中溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于淀粉的糊化溫度，沒有劇烈的反應(yīng)，體系黏度比傳統(tǒng)過程低得多［7－8］，因此可以大幅提高發(fā)酵濃度而不必過分擔(dān)心黏度問題。同時(shí)由于生料過程中，葡萄糖是逐步緩慢釋放的，因此可以進(jìn)行濃醪發(fā)酵而減輕高初糖濃度和高滲透壓對(duì)酵母的生長(zhǎng)抑制。

相關(guān)研究表明，傳統(tǒng)的濃醪發(fā)酵溫度對(duì)酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵效率非常重要［16－18］，采用溫度梯度培養(yǎng)方式進(jìn)行的研究近期有所報(bào)道［12，19］，而針對(duì)玉米生料濃醪發(fā)酵過程中溫度影響的研究尚未見報(bào)道，對(duì)酵母在不同工藝中的數(shù)量和形態(tài)的研究也未見報(bào)道。本文以玉米為原料，對(duì)不同過程的黏度變化與酵母情況進(jìn)行考察，同時(shí)研究不同溫度控制方式對(duì)玉米超高濃度酒精發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

全磨40目玉米粉，中糧肇東酒精廠試驗(yàn)室提供;安琪牌釀酒高活性干酵母(耐高溫型)。

1.1.2 主要酶制劑

顆粒淀粉水解酶(STARGEN 001)，酶活力443 GAU/g;高溫淀粉酶(SPEZYME ALPHA)，酶活力15170AAU/g;糖化酶(GA-L-NEW)，酶活力100000wu/g;酸性蛋白酶(FERMGEN)，酶活力1000SAPU/g。均為杰能科國(guó)際公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑

無水乙醇(HPLC)，北京色譜中心;葡萄糖(HPLC)，Sigma公司;麥芽糖(HPLC)，Sigma公司;甘油(HPLC)，北京色譜中心;乳酸(HPLC)，北京色譜中心;乙酸(HPLC)，北京色譜中心;純水，Millipore制備，純水電阻18.2 MΩ。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓液相色譜，Agilent 1100系列;快速黏度儀，Perten RVA 4500;顯微鏡，OLYMPUS CX40，配DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng);Brix計(jì)，Mettler Toledo RE40D折光計(jì);天平，Sartorius系列;移液槍，熱電(上海)儀器有限公司;酸度計(jì)，Mettler Toledo Delta 320系列;冷卻電熱恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司特制。

1.3 分析方法

1.3.1 醪液黏度測(cè)定

Perten RVA 4500快速黏度儀，程序根據(jù)試驗(yàn)需求設(shè)定，醪液量28.00g。

1.3.2 酵母測(cè)定

OLYMPUS CX40顯微鏡下觀察，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，大小由DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng)分析。

1.3.3 發(fā)酵醪組成測(cè)定

高效液相色譜法HP1100高效液相色譜儀，HP Chemstations色譜工作站，色譜柱Bio-Rad 87H。色譜分離操作條件(常溫下進(jìn)行)流動(dòng)相0.01 mol/L H2SO4;流速 0.6 mL/min;柱溫 60℃;進(jìn)樣量 20 μL。

1.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)測(cè)定

蒸餾-比重法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同工藝對(duì)黏度的影響

生料工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測(cè)定水分，配制成絕對(duì)干物。濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調(diào)整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 1.5G AU/g，編輯程序如表1所示，取28.00 g醪液進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果詳見圖1。可溶性干物用Mettler Toledo RE40D折光計(jì)測(cè)量，結(jié)果如圖2所示。

傳統(tǒng)工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測(cè)定水分，配制成絕對(duì)干物濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調(diào)整至 5.6，加入高溫淀粉酶 SPEZYME ALPHA 0.04%，編輯程序如表1所示，取28.00 g醪液進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果詳見圖1。可溶性干物用Mettler Toledo RE40D折光計(jì)測(cè)量，結(jié)果如圖2所示。

表1 不同工藝黏度測(cè)定程序

圖1 玉米超高濃度醪液傳統(tǒng)工藝與生料工藝粘度對(duì)比

如圖1所示，在醪液濃度為35% 的情況下，即便采用生料工藝，即恒定溫度32℃，由于醪液非常濃，(按玉米粉水分16%計(jì)，料水比達(dá)到1∶1.46)，醪液的黏度可達(dá)530×10－3Pa·s左右。若采取傳統(tǒng)工藝，由于反應(yīng)劇烈，醪液的黏度在整個(gè)過程中有著巨大的變化。在50℃預(yù)熱階段傳統(tǒng)工藝的黏度低于生料工藝32℃的黏度;這是由于流體的黏度從結(jié)構(gòu)上被認(rèn)為是由于分子間的相互作用力限制分子的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的。這些作用力取決于決定分子自由空間度的分子間的相互距離，同時(shí)分子間距受溫度影響顯著。在較高的溫度下，隨著分子間距的增加，分子熱運(yùn)動(dòng)能提高，提供分子躍遷的孔穴增多，流動(dòng)阻力減小，故體系黏度下降［20］;隨著溫度進(jìn)一步升高，淀粉顆粒開始迅速膨脹，當(dāng)溫度升高到60～80℃，淀粉顆粒的體積可膨脹到原來的50～100倍，淀粉分子間的作用力減弱，引起淀粉顆粒的部分解體，醪液由原來的固、液兩相形成均一的黏稠液體［21］，在此糊化過程中，盡管高溫淀粉酶SPEZYME ALPHA的添加量達(dá)到0.04%，醪液黏度的峰值仍達(dá)到9.2 Pa·s以上;在90℃液化過程中，淀粉被酶分子水解，不斷變成小的葡萄糖聚合體，醪液黏度顯著降低;但在隨后的降溫過程中，流動(dòng)阻力不斷加大，醪液黏度逐步上升，當(dāng)醪液溫度降至32℃時(shí)，黏度值達(dá)到2.5 Pa·s以上。在酒精行業(yè)，一般認(rèn)為醪液黏度超過2 Pa·s，會(huì)造成過程料液輸送困難和發(fā)酵傳質(zhì)困難［21］，故對(duì)于超高濃度35%來講，糊化、液化變得非常困難，高黏度的液化液會(huì)引起一系列的問題，如輸送困難，換熱效率大大下降，發(fā)酵的傳質(zhì)不好從而影響整個(gè)工廠的運(yùn)轉(zhuǎn)等等。

圖2 傳統(tǒng)工藝與生料工藝玉米超高濃度醪液可溶性干物質(zhì)對(duì)比

如圖2所示，傳統(tǒng)工藝的可溶性干物達(dá)到34.5Brix，生料工藝的可溶性干物僅為6.5Brix，高濃度的可溶性物質(zhì)會(huì)對(duì)體系中的滲透壓、水活度、溶氧、酵母的活性等各方面產(chǎn)生負(fù)面影響，從而不利于發(fā)酵的進(jìn)行。

2.2 不同工藝玉米高濃度酒精發(fā)酵

考慮到35%絕干濃度的料液即便是在實(shí)驗(yàn)室的研究過程中傳質(zhì)也已經(jīng)非常困難，故采用絕干濃度為31%的料液對(duì)2種工藝進(jìn)行比較。

生料工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測(cè)定水分，配制成絕對(duì)干物濃度為31%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH值調(diào)整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 0.785GAU/g，接入0.4%活化好的干酵母于32℃發(fā)酵，不同時(shí)間取樣進(jìn)行色譜分析結(jié)果如表2所示;發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)酵母顯微鏡觀察，用DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)大小，結(jié)果如圖2所示。

傳統(tǒng)工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測(cè)定水分，配制成絕對(duì)干物濃度為31%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調(diào)整至 5.6，加入高溫淀粉酶 SPEZYME ALPHA 0.04%，于90℃水浴中維持90 min，取出先粗調(diào)pH，滅酶，冷卻至室溫，并補(bǔ)水至記錄的體積以補(bǔ)充在此過程中蒸發(fā)的水分，調(diào)節(jié)pH至4.2，滅酶，添加新型液體糖化酶GA-L-NEW，添加量為0.1%;酸性蛋白酶，添加量0.01%;接入0.4%活化好的干酵母于32℃發(fā)酵，不同時(shí)間取樣進(jìn)行色譜分析結(jié)果見表2。發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)酵母顯微鏡觀察，用DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)大小，結(jié)果如圖3所示。

表2 傳統(tǒng)工藝與生料工藝HPLC對(duì)比

如表2所示，對(duì)傳統(tǒng)工藝來講，三糖以上的含量由24 h的1.26%降低到68 h的0.51%，表明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糖化酶逐步把糊精/淀粉水解成葡萄糖;三糖的含量也從0.13%降低到0.06%;二糖的含量總體變化不大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)有0.39%的殘余;葡萄糖的含量變化較大，24h高達(dá)13.59%，表明即使采取邊糖化邊發(fā)酵工藝，由于發(fā)酵前期糖化酶釋放葡萄糖的速度遠(yuǎn)比酵母將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的速度快，會(huì)形成一定程度的葡萄糖積累，而相關(guān)研究表明，較高的糖濃度會(huì)產(chǎn)生底物抑制作用，使酵母生產(chǎn)能力降低［19］，隨著發(fā)酵的進(jìn)行糖化酶釋放出的葡萄糖被酵母逐步轉(zhuǎn)化為酒精，發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘余的葡萄糖含量為0.22%;而對(duì)生料工藝來講，整個(gè)發(fā)酵過程中三糖以上幾乎沒有變化，表明淀粉是在顆粒狀態(tài)下(完全沒有溶出)被生料顆粒酶水解的，麥芽三糖含量始終為0，二糖和葡萄糖的含量在整個(gè)發(fā)酵過程中一直維持很低水平，發(fā)酵結(jié)束時(shí)均為0，也就是說整個(gè)過程中沒有糖的累積，酵母始終處于一種饑餓并代謝旺盛的狀態(tài)，生料酶水解出來的葡萄糖完全被酵母利用;2個(gè)工藝的乳酸含量接近，乙酸含量生料工藝略低于傳統(tǒng)工藝，表明生料過程沒有發(fā)生染菌，并且減少了有機(jī)酸的產(chǎn)生;值得一提的是。甘油的產(chǎn)量，生料工藝遠(yuǎn)低于熟料工藝，表明由于生料工藝不會(huì)產(chǎn)生可溶性干物質(zhì)，體系中的滲透壓很低，生料過程中酵母細(xì)胞內(nèi)的受氫體乙醛的產(chǎn)生比傳統(tǒng)工藝快且多，代謝途徑不再朝甘油方向進(jìn)行，與傳統(tǒng)工藝相比，生料過程的副產(chǎn)物大幅降低，由于甘油非常好的保濕性，甘油產(chǎn)量的減少還意味著DDGS干燥過程的改善;生料過程的酒精產(chǎn)量高于傳統(tǒng)工藝，這意味著出酒率的提高和糧耗的降低，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因分析見后。

圖3 傳統(tǒng)工藝與生料工藝發(fā)酵終點(diǎn)酵母數(shù)對(duì)比

如圖3所示，發(fā)酵結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)工藝的酵母數(shù)為3.7×108/mL，生料工藝為2.5×108/mL，生料工藝的酵母數(shù)比傳統(tǒng)工藝少很多，表明生料過程用于合成酵母的糖耗低于傳統(tǒng)過程。

圖4 傳統(tǒng)工藝DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)

由圖4和圖5所示，傳統(tǒng)過程的酵母平均面積為21.61μm2，生料過程的酵母平均面積為13.21μm2，傳統(tǒng)過程有約40%的酵母平均面積大于20.0μm2，生料過程大于20.0μm2的僅為13%左右。傳統(tǒng)過程的酵母比生料過程大很多。相關(guān)研究表明，在傳統(tǒng)工藝中，液化后進(jìn)行糖化的過程比邊糖化邊發(fā)酵的流加糖過程提供了更高的初糖，但營(yíng)養(yǎng)過剩反而會(huì)造成酵母過快生長(zhǎng)，體積較大，后期產(chǎn)生酒精的能力不強(qiáng)［22］。綜合色譜結(jié)果，在生料過程與傳統(tǒng)的邊糖化邊發(fā)酵過程的對(duì)比中，發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，傳統(tǒng)過程的酵母?jìng)€(gè)頭大但產(chǎn)酒能力不如生料過程中個(gè)頭小的酵母，由此可見，在酒精生產(chǎn)上，在保證酵母菌能達(dá)到一定的數(shù)量后，酵母菌的個(gè)體質(zhì)量更為關(guān)鍵!

圖5 生料工藝DT2000真彩色圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)圖

綜上所述，以下因素可能是導(dǎo)致生料過程的酒精產(chǎn)量高于傳統(tǒng)過程的原因:

(1)相關(guān)研究表明，玉米中的游離糖含量為1.0% ～3.0%［23］，如果采用傳統(tǒng)蒸煮過程，這些游離糖有相當(dāng)量會(huì)與蛋白發(fā)生反應(yīng)，或在高溫下發(fā)生其它變化而變?yōu)椴豢砂l(fā)酵性糖，生料過程由于避免了高溫，使這部分糖得以利用;

(2)由于生料工藝不會(huì)產(chǎn)生可溶性干物質(zhì)，體系中的滲透壓很低，發(fā)酵過程的副產(chǎn)物如甘油、有機(jī)酸減少，能使更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化成酒精;

(3)生料過程中的酵母數(shù)少于傳統(tǒng)過程，酵母小于傳統(tǒng)過程，表明用于合成酵母的葡萄糖少于傳統(tǒng)過程，使得更多的糖轉(zhuǎn)化成酒精。

2.3 溫度梯度控制超高濃度酒精發(fā)酵

前期相關(guān)研究表明［12］，對(duì)于超高濃度生料酒精發(fā)酵，在恒定培養(yǎng)溫度條件下，發(fā)酵溫度越高前期酒精的生產(chǎn)速率越高，但酵母衰老的也越早，酒精的產(chǎn)物抑制也越嚴(yán)重;低溫發(fā)酵雖然非常有利于發(fā)酵后期酒精的生產(chǎn)，但前期產(chǎn)酒較慢，發(fā)酵周期偏長(zhǎng)。溫度梯度控制是實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度超高酒精發(fā)酵的重要途徑。本文將繼續(xù)探討溫度梯度控制對(duì)玉米超高濃度酒精發(fā)酵的影響。

生料溫度梯度控制工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測(cè)定水分，配制成絕對(duì)干物濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調(diào)整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 1.5GAU/g，接入0.4%活化好的干酵母，發(fā)酵過程中對(duì)醪液分別在32、28、25、20℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行溫度梯度控制(詳見圖6)。不同時(shí)間取樣用HPLC測(cè)定發(fā)酵醪組成，發(fā)酵結(jié)束采樣進(jìn)行蒸餾測(cè)定醪液在標(biāo)準(zhǔn)條件下的酒精含量，結(jié)果如圖7所示。

圖6 生料工藝不同方式溫度梯度控制

圖6顯示了不同溫度梯度控制的方式，其中方式一為3次降溫，其余為2次降溫。

圖7 梯度降溫策略對(duì)玉米超濃醪生料酒精發(fā)酵的影響

圖7顯示了濃度為35%生料濃醪酒精發(fā)酵采取不同方式溫度梯度控制過程中葡萄糖濃度和酒精的變化。由圖7可知，采取方式一(0～27 h 32℃，27～46 h 28℃，46～49 h 25℃，49～98 h 20℃)的培養(yǎng)方式，葡萄糖濃度在72 h出現(xiàn)下降，說明整個(gè)過程降溫不夠及時(shí)，導(dǎo)致最終乙醇含量較低(20.06%)，且殘余葡萄糖最高(2.01%);采取方式二(0～27 h 32℃，27～46 h 25℃，49～98 h 20℃)和采取方式三(0～24 h 32℃，24～46 h 28℃，46～98 h 20℃)以及方式四(0～24 h 32℃，24～46 h 28℃，46～98 h 20℃)的培養(yǎng)方式，葡萄糖濃度從46 h出現(xiàn)下降，殘余葡萄糖分別為1.03%，1.15%，1.67%，乙醇分別為20.45%，20.53%，20.13%，若采取方式五(0～24 h 32℃，24～46 h 25℃，46～98 h 20℃)的培養(yǎng)方式，葡萄糖濃度在24 h達(dá)到高點(diǎn)后持續(xù)降低，最終乙醇達(dá)到20.79%，殘余葡萄糖僅0.46%。由此可見，溫度是超高濃度酒精發(fā)酵過程中影響菌體生長(zhǎng)的重要因素，對(duì)于超高濃度玉米酒精生料發(fā)酵，及時(shí)合理調(diào)整發(fā)酵溫度至關(guān)重要，方式三和方式五的發(fā)酵效果較為理想。

總體來講，由于采取生料無蒸煮工藝，葡萄糖逐步緩慢釋放，淀粉未溶出，整個(gè)體系的滲透壓非常低;采取適當(dāng)?shù)臏囟忍荻瓤刂撇呗裕菇湍讣?xì)胞的活力得以長(zhǎng)久維持，增強(qiáng)了酵母生產(chǎn)乙醇的能力和對(duì)酒精的耐受性，采取生料無蒸煮工藝，使用普通市售酒用干酵母，在98 h內(nèi)發(fā)酵醪液乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)20%以上。

3 總結(jié)與展望

高濃發(fā)酵，節(jié)能、高效、減少投資、減少操作單元、更好的副產(chǎn)品是酒精工業(yè)化生產(chǎn)的期望，酶制劑的進(jìn)步使得本來非常困難的問題在新的工藝過程中不再成為制約的瓶頸，如超高濃度發(fā)酵時(shí)的黏度問題，超高濃度發(fā)酵所需的特殊耐高酒度的酵母等等。本文通過溫度梯度控制策略，采取玉米生料無蒸煮工藝，使用普通市售酒用干酵母，在98 h內(nèi)發(fā)酵醪液乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)20%以上，為進(jìn)一步深入研究超高濃度酒精發(fā)酵提供了新的思路。

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