氮源對2株海洋微藻生長及脂肪酸合成的影響*

吳偉偉，隆小華，劉兆普，高影影，王長海

(南京農業大學資源與環境科學學院江蘇省海洋生物學重點試驗室，江蘇南京，210095)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)與扁藻(TetraselmisChui)是分別屬于羽紋硅藻(Pennate)和綠藻門(Chlorophyceae)的2種不同種類的海洋微藻，均具有適應性強、易于培養和含油量高等特點，尤其是在生長過程中其細胞內可大量積累多種高不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)［1］。

氮源對海洋微藻的生長與脂肪酸合成過程具有重要的影響。為了進一步提高三角褐指藻與扁藻的產脂肪酸能力，探討氮源對其生長和生產脂肪酸能力的影響，本試驗選取了NaNO3、NH4Cl和尿素等3種氮源，較詳細地研究其對三角褐指藻和扁藻生長、葉綠素含量、可溶性糖、可溶性蛋白、細胞干重及總脂的影響，著重分析了不同氮源對2種微藻脂肪酸組成及含量的影響，為進一步確定2株微藻的最適氮源和氮源利用方式提供基礎［2］。

1 材料與方法

1.1 藻種

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、扁藻(TetraselmisChui)，藻種購自中科院青島海洋研究所微藻種質庫，經江蘇省海洋生物學重點試驗室分離純化后備用。

1.2 培養條件

試驗采用人工海水(稱取31 g的海鹽，溶于1 L蒸餾水中，配制成鹽度為3.1%的人工海水)，經脫脂棉過濾，高溫高壓滅菌20 min，并分別以 NaNO3、尿素、NH4Cl為氮源的F/2作為基礎培養基。試驗在500 mL三角瓶中進行，培養體積為250 mL，每個處理3個平行組。培養溫度為(20±1)℃，光暗比為14∶10(光照強度為2500 lx)。每天定時搖瓶2～3次，隨機變換三角瓶的位置。

1.3 微藻生物量的測定與收獲

分別利用顯微鏡計數和分光光度計測定微藻細胞個數與培養液的吸光值，依據多天的測定結果得出2株微藻生物量(細胞密度)與吸光值之間的線性關系。微藻的相對生長速率計算:

其中，N0是起始時藻液的吸光值;Nt是收獲時藻液的吸光值［3］。

在指數生長期末期，利用超速冷凍離心機5 000 r/min離心15 min收集藻液，冷凍干燥，將得到的藻粉置于超低溫冰箱中保存，以備測脂肪酸。

1.4 葉綠素測定

取相同體積指數生長末期的藻液，利用超速冷凍離心機于5 000 r/min離心15 min后加入等體積丙酮，黑暗條件下放置24 h，后于4 000 r/min下離心10 min，取上清液于645 nm和663 nm測OD值，計算葉綠素質量濃度(mg/L)［4］。

1.5 可溶性糖和可溶性蛋白測定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法［5］;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定［5］。

1.6 干重

取一定體積指數生長末期的藻液，利用超速冷凍離心機，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，后經冷凍干燥稱重。

1.7 總脂

經冷凍干燥后的藻液，采用Bligh＆dyer的方法提取脂質［6－7］;后經真空蒸發后計算粗脂肪的含量［6］。

1.8 脂肪酸組成的氣相色譜分析

向提取得到的脂質中加入1～2 mL的0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，40℃水浴10 min后加入2 mL正己烷，再將樣品轉移至10 mL具塞量筒中，加水至頂端，振蕩后靜置至溶液分層，取上層有機相進行氣相色譜分析［8］。采用Agilent7890氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，HP-5柱子，升溫程序:170℃保持5 min，以5℃/min升至250℃，保持10 min。進樣口，檢測器的溫度為250℃。載氣為高純度氮氣，流速為90 mL/min，進樣量1 μL。脂肪酸甲酯標準品為Simga 公司產品［6，8］。

1.9 數據統計分析

試驗所有數據用平均值±標準差(x±s)表示，采用Excel 2003和SPSS16.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 氮源對三角褐指藻和扁藻生長的影響

對2株微藻細胞密度與吸光值之間進行回歸分析，得到二者的線性關系式，三角褐指藻為:Y=117.82×104X+529.25×104(R2=0.998 6)，其中X為藻液吸光值A656，Y為藻細胞密度;扁藻為:Y=161.85×104X－105.24×104(R2=0.997 9)，其中X為藻液吸光值A682，Y為藻細胞密度。可見，在本試驗范圍內，三角褐指藻及扁藻的細胞密度與吸光值均呈線性相關，可利用藻液的吸光值表示微藻的生長情況。

3種氮源對三角褐指藻相對生長速率的影響依次為:尿素＞NaNO3＞NH4Cl，且差異性顯著;其中尿素對三角褐指藻生長的影響最大，生物量最高(圖1)。

3種氮源對扁藻相對生長速率的影響依次為:NH4Cl＞尿素＞NaNO3;即NH4Cl對扁藻生長的影響最大，但是彼此間的差異性不顯著(圖2)。

圖1 不同氮源對三角褐指藻吸光值(A)和相對生長速率(B)的影響

圖2 不同氮源對扁藻吸光值(A)和相對生長速率(B)的影響

2.2 氮源對三角褐指藻和扁藻葉綠素含量的影響

從圖3可知，氮源對2株海洋微藻葉綠素含量影響差異性顯著。尿素為氮源時，三角褐指藻的葉綠素含量達到最大，依次為NaNO3，NH4Cl;其葉綠素含量分別下降了22.7%和43.0%(圖3)。扁藻以NH4Cl為氮源時，獲得最大的葉綠素含量，依次為尿素，NaNO3;其葉綠素含量分別下降了5.1%和11.5%(圖4)。

圖3 不同氮源對三角褐指藻葉綠素含量影響

2.3 氮源對三角褐指藻和扁藻可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

從圖5可知，尿素為氮源時，三角褐指藻的可溶性糖含量達到最大，依次為NaNO3，NH4Cl;其可溶性糖含量分別下降了3.3%和6.0%，且差異性顯著(圖5A)。尿素為氮源時，三角褐指藻可溶性蛋白含量達到最大，依次為NH4Cl，NaNO3;其可溶性蛋白含量分別下降了2.9%和21.3%。尿素與NH4Cl為氮源時，對三角褐指藻可溶性蛋白含量影響差異不顯著(圖5B)。

圖4 不同氮源對扁藻葉綠素含量的影響

圖5 不同氮源對三角褐指藻可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

圖6 不同氮源對扁藻可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

從圖6可知，NH4Cl為氮源時，扁藻的可溶性糖和可溶性蛋白含量均達到最大，依次為尿素和NaNO3;其可溶性糖分別下降了17.6%和26.8%，可溶性蛋白分別下降了1.5%和3.8%。氮源對扁藻可溶性糖及可溶性蛋白含量的影響差異性均顯著。

2.4 氮源對三角褐指藻和扁藻干重、總脂含量的影響

以尿素為氮源，三角褐指藻的干重達到了最大量，為 1.21 g/L，其次為 NaNO3，NH4Cl，其干重分別下降了5.0%和10.0%(圖7A)。NH4Cl為氮源的時候，三角褐指藻的總脂達到了最大量，為47.5%，其次為NaNO3，尿素，分別下降了27.7%，36.2%，且差異性顯著(圖7B)。

NH4Cl為氮源的時候，扁藻的干重達到了最大量，為0.89 g/L，依次為尿素，NaNO3;其干重分別下降了21.3%和30.3%(圖8A)。NaNO3為氮源的時候，扁藻的總脂達到了最大量為 38.5%，依次為 NH4Cl，尿素，但差異性不顯著(圖8B)。

圖7 不同氮源對三角褐指藻干重(A)和總脂(B)的影響

圖8 不同氮源對扁藻干重(A)和總脂(B)的影響

2.5 氮源對三角褐指藻和扁藻脂肪酸組成與含量的影響

氣相色譜數據分析表明，以尿素為氮源時，三角褐指藻的脂肪酸種類增多，但脂肪酸總量減少。3種氮源培養條件下，三角褐指藻的總單不飽和脂肪酸(TMUFA)含量均大于飽和脂肪酸(TSFA)和多不飽和脂肪酸含量(TPUFA)。NH4Cl為氮源時，三角褐指藻總脂肪酸的百分比達到最大，為39.59%，且TMUFA﹥TSFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的百分比分別為:17.64%、12.10%、9.85%。以 NaNO3為氮源時，其總脂肪酸的百分比為21.57%，且TMUFA﹥TSFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的11.59%、8.41%、1.57%。以尿素為氮源時，其總脂肪酸的百分比為15.28%，且TMUFA﹥TPUFA﹥TSFA，占總脂肪酸的百分比依次為12.69%、2.47%、0.12%。

NaNO3為氮源時，扁藻的脂肪酸種類及總量均增多，其總脂肪酸的百分比達到最大為20.82%，且TPUFA﹥TSFA﹥TMUFA，占總脂肪酸的百分比依次為10.41%、5.45%、4.96%。以NH4Cl為氮源時，其總脂肪酸的百分比為5.62%，且TSFA﹥TMUFA﹥TPUFA，占總脂肪酸的百分比依次為2.31%、2.29%、1.02%。以尿素為氮源時，其總脂肪酸的百分比為3.77%，且TMUFA﹥ TPUFA﹥ TSFA，占總脂肪酸的百分比依次為1.73%、1.39%、0.65%。氮源對不同微藻的脂肪酸組成影響不一致。

3 討論

通常情況下微藻可以利用的氮源有銨鹽、硝酸鹽及尿素等，但在吸收速度與利用程度上卻存在一定差異，且不同氮源對于微藻各項生理指標的影響也不同［9－10］。國內外關于氮源對微藻各項指標的影響意見并不一致，Ohmori［11］和 Guerrero［12］等先后報道了藍藻、藍綠藻對氨氮的吸收利用優于其它形式的氮源，認為微藻可以直接以NH+4作為合成氨基酸的原料;潘庭雙等［13］發現，微綠球藻以尿素和 NaNO3作氮源效果最好，NH4Cl效果較差;王順昌［14］等認為尿素對蛋白核小球藻生長、色素積累的效果優于氨態氮和硝酸態氮，硝酸態氮在中性脂肪積累上優于尿素氮和氨態氮。本實驗表明:三角褐指藻以尿素為氮源時生長最快;扁藻以NH4Cl為氮源時生長最快。這是因為三角褐指藻細胞內具有尿素酶，使尿素可以更好的被吸收同化，且尿素不改變培養液的酸堿反應，可以保持pH值的穩定更利于微藻的生長;而扁藻細胞內可能不具有尿素酶。這說明不同微藻對不同形式氮鹽喜好和利用能力存在差異。

微藻的色素積累受多種環境因素的影響，如光照、溫度等，其中氮源也是影響色素積累的因素之一，當培養液中氮源不足時，會導致葉綠素含量的降低［15］。我們的研究表明，三角褐指藻以尿素為氮源時葉綠素積累量達到最大;扁藻以NH4Cl為氮源時葉綠素積累量達最大，且3種氮源對兩種海洋微藻葉綠素積累的影響差異性顯著。這與氮源對微藻生長的影響結果一致。

本試驗結果表明，三角褐指藻以尿素為氮源時可溶性糖、可溶性蛋白含量達到最大，以NH4Cl為氮源時總脂含量達到最大。扁藻以NH4Cl為氮源時可溶性糖、可溶性蛋白含量達到最大;以NaNO3為氮源時總脂含量達到最大。由于糖、蛋白質對微藻生長至關重要，其要增殖必須積累糖類和蛋白質，相對而言總脂的合成量會降低。

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