BAT2缺失釀酒酵母基因工程安全菌株的構(gòu)建及其雜交育種*

張艷英，肖冬光，張翠英，王文陽(yáng)，汪東升，李月強(qiáng)

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

白酒是中國(guó)特有的蒸餾酒，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛(ài)。高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)是形成白酒風(fēng)味的重要物質(zhì)之一，若含量適宜，可使白酒口感柔和豐滿(mǎn)、味道獨(dú)特;但如果含量過(guò)高，會(huì)使白酒產(chǎn)生異雜味，影響酒的風(fēng)味和品質(zhì)，并且飲用后易上頭，危害身體健康;反之，高級(jí)醇含量不足，酒味將變得稀薄單調(diào)。因此，必須控制白酒中高級(jí)醇的含量。而我國(guó)目前以玉米等蛋白質(zhì)含量豐富的原料發(fā)酵生產(chǎn)的白酒中高級(jí)醇含量較高，發(fā)酵結(jié)束后總含量通常在300 mg/L(或300 mg/kg，以異丁醇和異戊醇計(jì))以上。

釀酒酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中，高級(jí)醇主要有兩條形成途徑，分別為氨基酸分解代謝途徑(Ehrlich途徑)［1］和糖代謝合成途徑［2］。BAT2 是控制酵母細(xì)胞質(zhì)中氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因，本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)同源重組構(gòu)建了BAT2缺失單倍體突變株A8-B和C22-B，但其染色體上帶有G418抗性基因KanMX且酵母單倍體突變株不穩(wěn)定，不能應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，因此必須去除A8-B和C22-B基因組上的G418抗性基因KanMX，并且將它們雜交成雙倍體，構(gòu)建優(yōu)良的低產(chǎn)高級(jí)醇基因工程安全菌株。

大腸桿菌P1噬菌體Cre基因的38.5ku產(chǎn)物(該產(chǎn)物是一種重組酶 ，recombinase)能識(shí)別并催化loxP位點(diǎn)間的重組;loxP位點(diǎn)含34bp，包括被8bp間隔的2個(gè)13bp反向重復(fù)，每個(gè)反向重復(fù)及其臨近的4bp 構(gòu)成一個(gè) Cre 蛋白的結(jié)合區(qū)［3－4］。Hegemann［5］等人構(gòu)建了loxP-Marker-loxP系列基因敲除體系，通過(guò)PCR反應(yīng)將loxP-Marker-loxP基因片段從模板質(zhì)粒pUG6擴(kuò)增出來(lái)，同時(shí)在兩端帶上擬敲除基因約50bp的同源區(qū)，此基因片段進(jìn)入酵母后與擬敲除基因發(fā)生同源重組，根據(jù)G418抗性篩選出陽(yáng)性克隆。然后將帶有Cre重組酶的質(zhì)粒導(dǎo)入陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)半乳糖的誘導(dǎo)表達(dá)將兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的抗性基因去除。文獻(xiàn)［6－7］就是利用Cre/loxp系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)loxP位點(diǎn)間目的片段的精確去除。

本文以2株BAT2缺失單倍體突變株為出發(fā)菌株，利用重組質(zhì)粒pGAPZA中的Cre重組酶編碼基因去除G418抗性基因KanMX，然后將這2株單倍體雜交成雙倍體菌株ΔBAT2，該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，以野生菌株和出發(fā)菌株為對(duì)照，通過(guò)白酒發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定了其主要發(fā)酵指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15及其生孢子得到的單倍體菌株A8和C22、BAT2缺失單倍體突變株A8-B和C22-B及質(zhì)粒pGAPZA(帶有Zeocin抗性和Cre重組酶基因)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋，電子天平，臺(tái)式高速離心機(jī)，生化培養(yǎng)箱，HS-1300-V型超凈臺(tái)，恒溫?fù)u床，光學(xué)顯微鏡，全自動(dòng)凝膠成像儀，GL20A型高速冷凍離心機(jī)，PCT-200型PCR基因擴(kuò)增儀，P型移液器，DYY-4c型電泳儀，AgilentGC 7890，DL102x型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 主要培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基，YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基(將YEPD培養(yǎng)基中葡萄糖改為半乳糖)，LB培養(yǎng)基，棉子糖生孢培養(yǎng)基［8］

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物

利用Primer5.0設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物(表1)。

表1 本文所用引物

1.4.2 酵母轉(zhuǎn)化

利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法［9］將pGAPZA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A8-B和C22-B中，提取酵母質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證pGAPZA質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入A8-B和C22-B中。

1.4.3 G418抗性基因的去除

已攜帶有pGAPZA質(zhì)粒的A8-B和C22-B在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)4～5 h，稀釋涂布，挑出單菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上，30℃靜置培養(yǎng)48 h。在YEPD上生長(zhǎng)而在G418抗性平板上不生長(zhǎng)即為所得到的菌株。提取酵母基因組，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證KanMX基因是否去除。

1.4.4 質(zhì)粒pGAPZA的丟失

將帶有質(zhì)粒pGAPZA的酵母菌株接入10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。按1∶100的接種量，接到新的10 mL YEPD培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)12 h，如此反復(fù)，直至pGAPZA質(zhì)粒丟失。取適量每次傳代的菌液稀釋涂布于YEPD平板上，挑取單菌落于5 mL YEPD中，培養(yǎng)12 h，提取酵母質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證pGAPZA質(zhì)粒是否丟失。

1.4.5 單倍體雜交

將單倍體菌株按照吳帥等所述方法［10］雜交成雙倍體，提取其基因組，PCR驗(yàn)證BAT2缺失且無(wú)G418抗性基因。

1.4.6 雙倍體的遺傳穩(wěn)定性

從斜面上挑取1環(huán)雙倍體ΔBAT2于5 mL YEPD培養(yǎng)基中，每隔12 h轉(zhuǎn)接1次，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接20次以上，對(duì)第 1、5、10、15、20 次的雙倍體進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。

1.5 分析方法

1.5.1 CO2失重的測(cè)定

接種二級(jí)種子于玉米糊培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)，按照文獻(xiàn)［11］描述的方法每隔12 h測(cè)CO2失重。

1.5.2 還原糖的測(cè)定

斐林試劑法［11］。

1.5.3 酒精度的測(cè)定

酒精計(jì)比重法［11］。

1.5.4 高級(jí)醇測(cè)定方法［12－13］

發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液得到含有高級(jí)醇的待測(cè)樣品。本試驗(yàn)測(cè)定高級(jí)醇的最佳條件為:色譜柱Agilent1909N －213:260℃;30 m ×320 μm ×0.5 μm;柱溫55℃保持5 min，然后以15℃/min的速度升溫至100℃，再保持6 min;進(jìn)樣口溫度230℃;檢測(cè)器溫度250℃;載氣流速1.000 mL/min保持5 min，然后以1.000 mL/min的速度升至5.000 mL/min，再保持1 min;氫氣流速30 mL/min;空氣流速400 mL/min;尾吹速度 25 mL/min;分流比 20∶1;進(jìn)樣量 1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 G418抗性基因的去除

2.1.1 pGAPZA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變株A8-B和C22-B

將質(zhì)粒 pGAPZA分別轉(zhuǎn)化 A8-B和 C22-B，在Zeocin抗性平板上挑轉(zhuǎn)化子，提取酵母質(zhì)粒，通過(guò)PCR驗(yàn)證篩選出帶有pGAPZA質(zhì)粒的菌株，PCR結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知pGAPZA質(zhì)粒上存在大小為1100bp的Cre基因和1200bp的 Zeocin抗性基因;未攜帶pGAPZA質(zhì)粒的A8-B和C22-B酵母質(zhì)粒上不存在Cre基因和Zeocin抗性基因;攜帶pGAPZA質(zhì)粒的A8-B和C22-B酵母質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增的Cre基因和Zeocin抗性基因片段與陽(yáng)性對(duì)照pGAPZA質(zhì)粒上擴(kuò)增到的片段大小一致。這些結(jié)果證明pGAPZA質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入釀酒酵母A8-B和C22-B中。

反映其成礦是在基性火山熔巖噴發(fā)間歇期沉積形成，其圍巖為基性火山巖(斜長(zhǎng)角閃巖)。說(shuō)明其成礦物質(zhì)來(lái)源除部分來(lái)自陸源外，大部分與其中火山沉積建造有關(guān)。

圖1 攜帶pGAPZA質(zhì)粒的釀酒酵母A8-B和C22-B的PCR驗(yàn)證

2.1.2 單倍體菌株ΔBAT2a和ΔBAT2α的獲得

半乳糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)已攜帶pGAPZA質(zhì)粒的A8-B和C22-B，利用影印平板法篩選出YEPD平板上生長(zhǎng)而G418平板上不生長(zhǎng)的菌株，分別命名為ΔBAT2a和ΔBAT2α，并通過(guò)PCR驗(yàn)證G418抗性基因是否去除，結(jié)果如圖2所示。

圖2 KanMX基因去除的PCR驗(yàn)證

由圖2可知，A8和C22基因組上存在完整的BAT2基因，PCR擴(kuò)增的BA-BAT2-BB片段大小為2100bp;BAT2缺失突變株A8-B和C22-B基因組上BAT2基因被抗性基因KanMX替代，PCR擴(kuò)增得到2600bp的BA-KanMX-BB重組盒和1 600bp的KanMX基因;ΔBAT2a和 ΔBAT2α 基因組上去除KanMX基因后PCR擴(kuò)增得到1100bp的BA-BB片段。這些結(jié)果證明已成功獲得了無(wú)G418抗性基因的菌株 ΔBAT2a和 ΔBAT2α。

2.1.3 pGAPZA質(zhì)粒的丟失

在YEPD培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 ΔBAT2a和ΔBAT2α，PCR驗(yàn)證pGAPZA質(zhì)粒是否丟失，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pGAPZA質(zhì)粒丟失PCR驗(yàn)證

由圖3可知，從ΔBAT2a和ΔBAT2α酵母質(zhì)粒上擴(kuò)增不到Zeocin抗性基因片段，證明pGAPZA質(zhì)粒已丟失。

2.2 單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α的雜交

將單倍體 ΔBAT2a和 ΔBAT2α 進(jìn)行雜交(圖4 A)，獲得雙倍體菌株ΔBAT2，并進(jìn)行生孢驗(yàn)證(圖4 B)。提取雙倍體菌株ΔBAT2的基因組，以BA-U和BB-D為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2泳道5(略)。

圖4 A，單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α的融合;B，雙倍體ΔBAT2的生孢驗(yàn)證

2.3 雙倍體的遺傳穩(wěn)定性

提取第1、5、10、15、20 次轉(zhuǎn)接的 ΔBAT2 的基因組，以BA-U和BB-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到大小為1 100bp的BA-BB片段，如圖2第5個(gè)泳道(略)，這就證明了單倍體ΔBAT2a和ΔBAT2α雜交的雙倍體ΔBAT2具有很好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 發(fā)酵試驗(yàn)

將野生菌株、出發(fā)菌株與BAT2缺失且無(wú)G418抗性基因的ΔBAT2同時(shí)進(jìn)行白酒發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定菌株的主要發(fā)酵指標(biāo)(表2)。

表2 菌株主要發(fā)酵指標(biāo)

由表2可以看出，BAT2缺失且無(wú)G418抗性基因的ΔBAT2與出發(fā)菌株A8-B和C22-B相比，CO2失重高，殘?zhí)堑?，乙醇含量?野生菌株AY15的異丁醇、異戊醇、總高級(jí)醇含量分別為 8.60 mg/100 mL、20.81 mg/100 mL、33.89 mg/100 mL，突變株 ΔBAT2的異丁醇、異戊醇、總高級(jí)醇含量分別為4.30 mg/100 mL、13.86 mg/100 mL、23.53 mg/100 mL，分別比野生菌株AY15降低50.00%、33.40%、30.57%。

3 討論

高級(jí)醇是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，但是其含量超過(guò)一定量又會(huì)影響到白酒風(fēng)味。在酵母菌發(fā)酵過(guò)程中，高級(jí)醇主要有兩條代謝途徑，一是氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑(Ehrlich代謝途徑)，另一是糖代謝途徑(Harris途徑)，分別由 BAT基因編碼的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶［14－15］和YDL080C基因編碼的類(lèi)丙酮酸脫羧酶調(diào)控［16］。本實(shí)驗(yàn)室前期敲除了野生菌株AY15的單倍體A8和C22基因組上的YDL080C基因，但獲得的突變菌株生成的異丁醇、異戊醇及總高級(jí)醇與野生菌株相比沒(méi)有明顯變化［17］;因此又構(gòu)建了氨基酸分解代謝途徑中細(xì)胞質(zhì)氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因BAT2完全缺失的突變株A8-B和C22-B［18］，但突變株染色體上帶有G418抗性基因KanMX且單倍體突變株不穩(wěn)定，不能進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，因此必須去除抗性基因KanMX并將其雜交成雙倍體，構(gòu)建優(yōu)良的低產(chǎn)高級(jí)醇基因工程安全菌株。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Cre/loxp系統(tǒng)去除BAT2完全缺失的突變株A8-B和C22-B染色體上的G418抗性基因KanMX，并將其雜交為雙倍體ΔBAT2，且雙倍體具有良好的遺傳穩(wěn)定性。白酒發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)建的基因工程安全菌株ΔBAT2與出發(fā)菌株A8-B和C22-B相比，CO2失重高，殘?zhí)堑?，乙醇含量?與野生菌株AY15相比，高級(jí)醇明顯降低。ΔBAT2生成的異丁醇、異戊醇、總高級(jí)醇分別為4.30 mg/100 mL、13.86 mg/100 mL、23.53 mg/100 mL，比野生菌株分別降低了50.00%、33.40%、30.57%。

基因工程安全菌株ΔBAT2的構(gòu)建不僅實(shí)現(xiàn)了低產(chǎn)高級(jí)醇，而且去除了G418抗性基因，具有雙倍體的遺傳穩(wěn)定性，可直接用于白酒工業(yè)生產(chǎn)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)成果對(duì)改善白酒品質(zhì)，提高我國(guó)釀酒工業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)水平和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

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