谷氨酸棒桿菌生產纈氨酸的代謝工程研究進展

王小元

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

谷氨酸棒桿菌生產纈氨酸的代謝工程研究進展

王小元

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

L－纈氨酸是人體必需的三種支鏈氨基酸之一，在生命代謝過程中起著非常重要的作用，因此被廣泛應用于食品、醫藥及飼料等行業。目前，L－纈氨酸主要采用微生物發酵法生產，而谷氨酸棒桿菌是最常用的生產菌種。作者分析了谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑和代謝調控，綜述了對其進行代謝工程改造來提高L－纈氨酸產量的最新研究進展。

谷氨酸棒桿菌；L－纈氨酸生產；代謝工程；發酵；支鏈氨基酸

自從1957年Kinoshita等人［1］報道了谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）可以發酵生產谷氨酸，該菌已逐漸被用來發酵生產各種氨基酸，包括L－纈氨酸（L－valine）。L－纈氨酸是人體必需的一種支鏈氨基酸，具有多種生理功能，因此被廣泛應用于食品、醫藥及飼料等行業。例如，L－纈氨酸在食品工業中用作營養強化劑和增香劑，在醫藥工業中用于制造復合氨基酸注射液和合成抗生素，在飼料行業中作為一種限制性氨基酸添加劑。由于其用途廣泛，市場上L－纈氨酸總是處于供不應求局面，帶動企業在L－纈氨酸產量及其生產成本等方面的良性競爭。目前，多數企業使用的L－纈氨酸生產菌來自于反復誘變，因而其遺傳背景不明，很難通過進一步誘變來提高L－纈氨酸產量。近年來，隨著谷氨酸棒桿菌全基因組測序及基因功能注釋的完成［2］，代謝工程已被于構建L－纈氨酸生產菌，成為提高L－纈氨酸發酵生產水平的最有效方法。眾所周知，優良的生產菌種是提高發酵產品產量和質量的保障。作者在分析谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑和代謝調控機理的基礎上，對其生產L－纈氨酸的代謝工程改造的研究進行綜述。

1 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸分子的生物合成途徑

谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的合成途徑見圖1。從丙酮酸出發，L－纈氨酸的合成先后涉及到乙酰羥酸合酶（AHAS）、乙酰羥酸同分異構酶（AHAIR）、二羥酸脫水酶（DHAD）和支鏈氨基酸轉氨酶（TA）等［3－5］。首先，由兩個基因ilv B和ilv N共同編碼的AHAS將兩分子的丙酮酸縮合成2－乙酰乳酸；其次，由基因ilvC編碼的AHAIR將2－乙酰乳酸轉化成雙羥基異戊酸；再次，由基因ilv D編碼的DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2－酮異戊酸；最后，由基因ilv E編碼的TA將2－酮異戊酸轉化成L－纈氨酸；由pd x R和avt A編碼的蛋白質在L－纈氨酸合成的最后一步也起到轉氨酶的作用［6］。另外，TA也能催化L－亮氨酸和L－異亮氨酸合成途徑的最后一步反應［5］。

谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的合成途徑還與其它一些主要代謝產物的合成途徑相互交錯，見圖1。首先，L－纈氨酸合成的關鍵前體物質丙酮酸（Pyruvate）同時也被用于合成L－丙氨酸（L－alanine）、乙酰Co A（Acetyl Co A）和草酰乙酸（Oxaloacetate）。其次，L－纈氨酸的合成與L－異亮氨酸（L－isoleucine）的合成共享AHAS、AHAIR、DHAD和TA等4種酶，但是這些酶在不同的合成途徑選用不同的底物。例如，AHAS以丙酮酸為底物合成L－纈氨酸，而用丙酮酸和2－酮丁酸二者為底物則合成L－異亮氨酸。AHAS對2－酮丁酸的親和性遠高于丙酮酸，因此在有2－酮丁酸存在時，丙酮酸被用來優先合成L－異亮氨酸，不利于 L－纈氨酸的積累［7］。最后，L－纈氨酸合成前體2－酮異戊酸的同時也被用于合成L－亮氨酸（L－leucine）和 D－泛酸（D－pantothenate）。針對這些特點，在優化谷氨酸棒桿菌生產L－纈氨酸時，不僅要加強L－纈氨酸的合成，還要考慮減弱其它相關代謝產物的合成，積累關鍵前體物質，將碳流導向L－纈氨酸的合成。

2 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸合成相關的調控機制

微生物細胞內存在復雜的代謝網絡，許多分子的合成都在DNA或蛋白質層次上受到嚴格調控，L－纈氨酸也不例外。L－纈氨酸合成途徑中的一些關鍵酶受到產物抑制或轉錄弱化作用調控。胞內合成的L－纈氨酸的胞外分泌也受到調控。因此，要對L－纈氨酸生產菌進行理性的代謝工程優化，必須對其調控機制進行全面了解。

2.1 氨基酸產物對乙酰羥酸合酶的反饋抑制

L－纈氨酸反饋抑制的主要對象是其合成途徑上的第一個關鍵酶AHAS。谷氨酸棒桿菌中AHAS全酶是四聚體，由兩個相同的大亞基和兩個相同的小亞基構成。大亞基為催化亞基，由ilv B基因編碼；而小亞基為調節亞基，由ilv N基因編碼。3種支鏈氨基酸均可以反饋抑制AHAS的小亞基［7－8］。L－纈 氨 酸、L－異 亮 氨 酸 和 L－亮 氨 酸 對AHAS的 半 抑 制 濃 度 分 別 為 0.9、3.1 和 6.0 mmol／L［3］。當濃度取5.0 mmol／L時，無論是單一的支鏈氨基酸，還是任意兩種或三種支鏈氨基酸組合，對AHAS活性的抑制程度均不會超過57%［8］。這些數據說明3種支鏈氨基酸在AHAS小亞基上的結合位點是相同的，但它們與該結合位點的親和性有差異。通過定點突變，對谷氨酸棒桿菌AHAS小亞基上20、21和22位的氨基酸進行替換，可獲得一個不受任何支鏈氨基酸反饋抑制的突變體［8］。

2.2 編碼乙酰羥酸合酶的基因轉錄弱化

在谷氨酸棒狀桿菌染色體上，基因ilv B、ilv N和ilv C串聯構成一個操縱元ilv BNC。Northern印跡實驗證明ilv BNC操縱元可以轉錄3種長度分別為3.9、2.3、1.1 kb的 m RNA；它們分別對應于ilv BNC、ilv NC和ilvC3種DNA 片段［4］。如果將ilv B的上游序列刪除，則只能獲得長度分別為2.3 kb和1.1 kb的m RNA；如果將ilv N的上游序列刪除，則只能獲得長度為1.1 kb的 mRNA［4］。這些數據說明ilv BNC操縱子中含有3個啟動子，因而基因ilvC可被轉錄3次，導致其表達效率在3個基因中最高。進一步研究發現，在ilv B上游292 bp處的一段DNA能表達一個短肽。這個短肽含有25個氨基酸，其中包括2個L－異亮氨酸、3個L－纈氨酸和2個L－亮氨酸，且短肽形成序列的后面存在能形成RNA莖環結構和轉錄終止子結構的序列［9］，說明這個短肽是對操縱元ilv BNC具有弱化調節作用的前導肽。前導肽翻譯偶聯的弱化作用對il－v BNC的轉錄調控進一步被Mobach等人用lacZ作為報告基因實驗證實［9］。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of L－valine in C.glutamicum

2.3 L－纈氨酸胞外分泌的調控

如果胞內的L－纈氨酸不能被及時分泌到胞外，積累的L－纈氨酸就會抑制其生物合成途徑中關鍵酶的活性，并弱化編碼關鍵酶的基因轉錄，使L－纈氨酸的合成速度降低。胞內的L－纈氨酸必須通過膜轉運酶Brn F和Brn E分泌到胞外［10］。全局基因表達分析發現，L－異亮氨酸的加入可以增加野生型谷氨酸棒桿菌中BrnF和BrnE的表達，但是對lrp敲除菌株沒有影響。通過與lrp和brn F的啟動子的轉錄融合表達分析，發現在培養基中添加3種支鏈氨基酸或L－甲硫氨酸均可以刺激brn FE的表達，但是這種刺激作用需要調控因子Lrp的存在［11］。芯片分析、帶轉變實驗和DNAse足跡分析證明Lrp結合在lrp和brn F之間的DNA上［11］。

3 L－纈氨酸代謝工程菌研究進展

L－纈氨酸工業生產菌主要來自于傳統誘變育種［12］，但目前代謝工程正在被用于谷氨酸棒桿菌的改良：利用已知的遺傳學信息，對L－纈氨酸代謝網絡進行系統分析，并采用基因工程技術改造谷氨酸棒桿菌以提高L－纈氨酸的產量［13－14］。近年來，一些適用于用于谷氨酸棒桿菌的表達載體已經被構建［15－17］。這些表達載體一般為大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體，含有較多的限制酶單酶切位點，有的是誘導性表達，有的是組成型表達。在谷氨酸棒桿菌中進行基因敲除的各種方法已經被建立［18－19］。由于同一啟動子在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的活性差別很大，所以針對谷氨酸棒桿菌中啟動子的研究也已經展開［20－21］。目前，人們已經從阻止雜酸合成、積累關鍵前體物質、解除反饋抑制和優化啟動子等方面入手構建出一些能高產L－纈氨酸的代謝工程菌，見圖2。通過解析影響L－纈氨酸合成的關鍵因素，對谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組進行優化或在其中高效表達關鍵基因均可以大幅度地提高 L－纈氨酸的產量［8，15，22－24］。

圖2 谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產菌的代謝工程優化Fig.2 Metabolic engineering of L－valine production strains

3.1 切斷旁支路并加強主干道碳流

如圖1所示，L－纈氨酸的合成與L－異亮氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸的合成交錯在一起。因此，要提高L－纈氨酸的產量，首先要通過基因敲除阻止雜酸合成，然后通過高效表達來進一步加強L－纈氨酸合成。L－異亮氨酸和L－纈氨酸的合成途徑共享的4個酶需要不同的底物。合成L－異亮氨酸最關鍵的前體是L－蘇氨酸在ilv A編碼的蘇氨酸脫氨酶作用下產生的2－酮丁酸，所以可以通過敲除基因ilv A阻止L－異亮氨酸的合成。2－酮異戊酸是L－纈氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸等3種酸的共同合成前體。由leu A編碼的異丙基蘋果酸合酶是L－亮氨酸合成途徑中的第一個關鍵酶，通過敲除基因leu A可以阻止L－亮氨酸的合成。從2－酮異戊酸到泛酸的合成涉及到3個基因pan B、panC和pan E，其中兩個關鍵基因panB和panC在染色體上位置相鄰，通過敲除這兩個基因可以阻止D－泛酸的合成。從丙酮酸出發合成L－纈氨酸需要5個基因ilv B、ilv N、ilv C、ilv D和ilv E。在基因組中，ilv B、ilv N和ilvC3個基因是串聯的，ilv D與ilv B只相隔兩個基因，而ilv E卻遠離其他基因。所以，基因ilv BNCD可以作為一個整體從基因組中擴增出來，通過載體高效表達來提高L－纈氨酸的產率。2002年，Radmacher等人通過缺失ilv A和pan BC基因并過量表達il－v BNCD基因構建了一個谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸高產 工 程 菌 株 ATCC 13032Δilv AΔpan BCpJC1ilv BNCD［15］。該菌株利用4 g／d L葡萄糖搖瓶培養48 h能產生91.9 mmol／L（10.8 g／L）的L－纈氨酸。

3.2 積累關鍵前體和儲備能源

L－纈氨酸合成的關鍵前體丙酮酸是細胞內非常重要的代謝產物，因此，降低丙酮酸的消耗也可以增加L－纈氨酸產量。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸的消耗方式主要有下列幾種：一是通過ala T和avt A等基因編碼的丙氨酸氨基轉移酶（AA）生成L－丙氨酸［25］；二是通過aceE等基因編碼的丙酮酸脫氫酶復合體（PDHC）直接合成乙酰－CoA，或通過pqo基因編碼的丙酮酸／奎寧氧化還原酶合成乙酸，再進一步合成乙酰－CoA；三是通過丙氨酸羧化酶（PC）合成草酰乙酸。敲除這些相關基因，就可以通過積累丙酮酸而增加L－纈氨酸產量或通過減少雜酸含量而降低其生產成本。比如，在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032ΔilvAΔpanBCpJC1ilvBNCD［15］中進一步敲除alaT基因，L－纈氨酸的產量雖然增加不明顯，但雜酸L－丙氨酸的含量降低了80%，最終導致下游分離純化成本的降低［25］。通過敲除aceE基因并過表達ilv BNCE而構建的ATCC13032ΔaceEpJC4ilv BNCE分批發酵能產生210 mmol／L（24.6 g／L）的 L－纈氨酸［22］，說明丙酮酸的累積確實能增加L－纈氨酸產量。進一步敲除pqo基 因，得 到 的 菌 株 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE能進一步提高L－纈氨酸的產量。由于培養丙酮酸脫氫酶缺陷型谷氨酸棒桿菌必須添加乙酸，這會影響葡萄糖的消耗，進而影響L－纈氨酸的合成［26］。Blombach等人［23］通過一系列實驗發現用乙醇代替乙酸可以解決這個問題。添加乙醇 來 分 批 發 酵 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE，葡萄糖的消耗速率是乙酸的6倍，66 h后積累了301 mmol／L （35.3 g／L）的 L－纈氨酸［23］。通過降低谷氨酸棒桿菌中H＋－ATPase的活性也可以積累丙酮酸［24］。將ATCC13032中染色體上atpG基因817位的T突變成C，導致其編碼的H＋－ATPase的273位的Ser變成Pro，得到突變株A－1。在A－1中導入質粒p VKilv N53C搖瓶發酵72 h能產生95.7 mmol／L（11.2 g／L）的L－纈氨酸［24］。質粒p VKilv N53C含有ilv N53和il－vC兩個基因，其中基因ilv N53編碼的AHAS小亞基在C－端缺少53個氨基酸，導致AHAS具有抗L－纈氨酸反饋抑制的能力。

輔因子也會對L－纈氨酸的合成造成影響。在L－纈氨酸的合成途徑中，消耗1 mol的葡萄糖，能產生2 mol NADH，同時消耗2 mol NADPH，才能合成1 mol L－纈氨酸。為了消除這種輔因子的影響，可以敲除編碼磷酸葡萄糖異構酶的基因pgi，增加通過磷酸戊糖途徑的碳流而生成更多的NADPH［27］。 這 樣 獲 得 的 菌 株的ATCC13032ΔaceEΔpqoΔpgipJC4ilv BNCE分 批 發 酵 能 產 生412 mmol／L（48.3 g／L）的L－纈氨酸［28］。最近，Hasegawa等人通過修飾AHAIR和取代TA的方式，將對輔因子NADPH的需求轉變成對NADH的需求，也大幅度提高了L－纈氨酸的產量［29］。

3.3 解除反饋抑制和優化啟動子活性

Elisakova等人［8］通過定點突變技術將染色體上ilv N基因編碼的AHAS的小亞基的第20～22位氨基酸由原來的GlyIleIle突變為Asp AspPhe，導致AHAS完全解除了3種支鏈氨基酸的反饋抑制，在此基礎上敲除了ilv A和pan B基因，并轉入重組質粒p ECKAilv BNC，構建的工程菌株ilv NM13Δilv AΔpanBpECKAilv BNC能產生130 mmol／L（15.2 g／L）的 L－纈氨酸。以ilv NM13菌株為背景，利用染色體定點突變技術，Holakto等人［30］首先通過減弱ilv A和leu A基因的啟動子活性，導致L－異亮氨酸和L－亮氨酸的合成速率下降，其次增強ilvD和ilvE基因的啟動子活性，所得菌株ilv NM13ΔpanBP－ilv AM1CGP－ilv DM7P－ilv EM6在48 h內搖瓶發酵能產生136 mmol／L （15.9 g／L）的L－纈氨酸。這些數據說明通過谷氨酸棒桿菌染色體上的定點突變來提高L－纈氨酸的產量也是可行的。

4 展 望

理性設計是代謝工程育種策略的最大優勢，這樣構建的谷氨酸棒桿菌不僅能夠最大限度地積累L－纈氨酸，而且能夠最大限度的減少雜酸，簡化后續分離提純工藝，降低生產成本。目前，谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產菌的理性設計研究主要圍繞L－纈氨酸的生物合成途徑，從以下幾個方面展開：首先，在DNA層次上進行其編碼基因的序列分析，通過定點突變消除轉錄弱化的調控和改變啟動子的活性；其次，在蛋白質層次上解析這些酶的催化結構域和調節結構域，通過理性改造提高其催化活性和抗反饋抑制能力；最后，通過高效表達其編碼基因將碳流最大限度地導向L－纈氨酸的合成。

L－纈氨酸的生物合成途徑固然是優化改進谷氨酸棒桿菌的關鍵，但并不是全部。要構建最優的谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產菌，還有很多其它的因素要考慮。未來代謝工程研究應針對谷氨酸棒桿菌細胞的整體代謝網絡，結合轉錄組學、蛋白組學、代謝組學和計算機建模等現代生物技術［31］，全面分析影響L－纈氨酸生產的所有節點，提出全局性的菌種改進優化策略。

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Metabolic Engineering inCorynebacteriumglutamicumto Increase L－Valine Production

WANGXiao－yuan

（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L－valine，one of the three branched－chain amino acids，is essential for human，and plays an important role in the metabolism of life，therefore，it is widely used in products of food，medicine and feed.L－valine is mainly produced by bacterial fermentation，and the most used bacterium is Corynebacterium glutamicum.In this article，the pathway and regulation of L－valine biosynthesis in C.glutamicum are analyzed and researches on metabolic engineering to increase L－valine production in C.glutamicum are reviewed.

Corynebacteriumglutamicum，L－valine production，metabolic engineering，fermentation，branched－chain amino acids

Q 933

A

1673－1689（2012）03－0225－07

2012－02－20

王小元（1965－），男，山西垣曲人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業微生物代謝工程方面的研究。E－mail：xiaoyuanwang＠hotmail.com