高效液相色譜法測定肉制品中甘草抗氧化物的含量*

譚波濤，郝媛媛，丁軼聰

（阜陽市產品質量監督檢驗所，安徽阜陽 236112）

高效液相色譜法測定肉制品中甘草抗氧化物的含量*

譚波濤，郝媛媛，丁軼聰

（阜陽市產品質量監督檢驗所，安徽阜陽 236112）

建立了測定肉制品中甘草抗氧化物含量的方法。樣品經流動相提取，采用C18色譜柱分離，以甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸（體積比70∶29∶1）為流動相，流速為1.0m L/m in，波長為250nm，以保留時間進行定性，峰面積進行定量。甘草酸在 1.0～80.0μg/m L 范圍內線性關系良好，回歸方程為 y=8.55×10－5x-0.599（r=0.999 7），檢出限為 1.0mg/kg，定量限為 3.0mg/kg，加標回收率為 95.7%～103.4%，測定結果的相對標準偏差為 1.57%～3.53%（n=6）。該方法適用于檢驗機構日常檢驗中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的測定。

高效液相色譜；肉制品；甘草抗氧化物

甘草抗氧化物（Antioxidant of glycyrrhiza,CNS號 04.008）是一種抗氧化劑，以甘草中提取出的甘草浸膏或甘草酸后的殘渣為原料，用乙醇或其它有機溶劑提取后經脫溶濃縮、干燥而得的產品[1,2]，其含量通常以甘草酸計。甘草酸分子式為C42H62O16,摩爾質量為822.93 g/mol。《食品添加劑使用衛生標準》[3]中規定，在基本不含水的脂肪和油、方便米面制品、餅干、腌臘肉制品、醬鹵肉制品、熏燒烤肉類、油炸肉類、西式火腿、肉灌腸類、發酵肉制品、腌制水產品、油炸食品等中允許限量使用，最大使用量均為0.2 g/kg，在其它食品中不允許使用。臨床醫學研究證明，長期濫用甘草酸會產生全身浮腫、血鈉濃度增高等現象，最終導致高血壓等疾病。

肉制品中甘草抗氧化物的測定，目前國內缺少相應的標準方法，文獻報道的多為高效液相色譜法、薄層掃描法等測定中藥材中的甘草酸含量[4-8]。筆者建立一種高效液相色譜法測定肉制品中甘草抗氧化物的方法，該方法精密度、準確度高，檢出限低，實用性強，適用于檢驗機構日常檢驗需求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Aglient 1260型，配二級管陣列檢測器、多功能自動進樣器，美國Aglient公司；

去離子水發生器：AXLB 1020-1型，美國阿修羅科技發展有限公司；

高速旋轉離心機：TDZ 4-WS型，西安東瑞科教實驗儀器有限公司；

電子天平：BSA 224S型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；

超聲波儀：SK 1200H型，上海科導超聲儀器有限公司；

甲醇：色譜純；

甘草酸標準品：純度不低于99%，上海安譜科技有限公司；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨、冰乙酸：分析純；實驗室用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Aglient C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.2 mol/L 乙酸銨 -冰乙酸(體積比 70∶29∶1)；流速：1.0m L/m in；進樣量：10μL ；柱溫：30℃。

碳交易促進企業改善技術水平，提高長期經濟效益。碳交易市場是政府根據外部性原理強行創造出來的一個新市場，所以碳交易市場在誕生和成長過程中，影響最大的都是政策性因素；當地區生產總值較高時，碳排放數量也較高，但是碳排放數量高不一定導致碳交易金額高，一般來說，碳配額不足的企業會購買配額，碳配額多余的企業會出售配額，但是企業的碳配額充足與否與企業的碳排放數量無關，主要與企業自身的技術水平和碳交易政策等因素相關；企業無法改變國家的碳交易政策，所以企業會不斷改善技術水平，以降低碳排放成本，同時提高企業的長期經濟效益。

1.3 樣品前處理

稱取樣品 2.0～3.0g（精確至 0.1 mg）于 25 m L比色管中，用流動相適當溶解并稀釋樣品，然后加入乙酸鋅溶液（220g/L）和亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）各2 m L，稍震蕩后用流動相定容至25 m L,超聲30min，以3 000r/m in高速離心10m in，取上清液待測。

1.4 甘草酸標準溶液的制備

準確稱取甘草酸標準品適量，以流動相溶解定容，配制成1.0mg/m L標準儲備液。

1.5 測定方法

取10μL樣品溶液和甘草酸標準使用溶液,分別注入高效液相色譜儀中,按1.2色譜條件,以色譜峰的保留時間定性,外標峰面積法定量測定。

2 結果與討論

2.1 提取方法的考察

甘草酸易溶于熱水、醇等極性溶液，幾乎不溶于乙醚。在方法研究時，對肉制品中甘草酸的提取用10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、流動相等作為溶劑進行提取比較，提取結果見表1。

表1 不同溶劑的提取結果

由表1數據可知，當使用流動相作為提取液進行提取時，提取率最高，因此采用流動相作為提取液。

2.2 樣品前處理方法的考察

針對含油脂及蛋白質量較多的肉制品，采用加沉淀劑法去除干擾，試驗中分別加沉淀劑乙酸鋅－亞鐵氰化鉀溶液 0.0，2.0，5.0m L 進行比較分析實驗。結果顯示，當沉淀劑添加量為0.0m L時，干擾峰較多；當添加量為2.0m L和5.0m L時，干擾峰較少，而甘草酸的回收率在可接受范圍內，選擇沉淀劑添加量為 2.0m L。

2.3 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對甘草酸標準溶液進行紫外光譜檢測。從甘草酸標準品色譜峰最高點提取的三維光譜圖發現，標準品在250nm附近有最大特征吸收。因此實驗選擇250nm作為甘草酸的檢測波長。

2.4 流動相的選擇

甘草酸因含有羧基而顯酸性，因此在流動相中加入少量酸性改性劑可以增加流動相的極性，降低待測物在色譜柱上的保留時間，以改善峰形；同時，在流動相中添加適量乙酸銨緩沖鹽能抑制樣品的電離，穩定樣品和pH值，優化色譜系統，為樣品的鍵合提供良好的環境，使峰型更好。實驗比較了乙腈-水-磷酸、甲醇-水-甲酸、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸等不同體系和比例流動相下樣品的分離情況，發現當流動相為甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰乙酸（70∶29∶1）時，樣品分離較好，響應值較高，且此時流動相的pH值亦在色譜柱的耐酸范圍內。

圖1 肉類樣品中甘草酸的色譜圖

2.5 色譜柱的選擇

根據甘草酸的性質及色譜柱的類別，對C8、C18等色譜柱進行分析比較試驗，發現C18色譜柱的分離效果最好。

2.6 線性方程及檢出限

吸取標準儲備液適量配制 1.0，10.0，20.0，40,0，80.0μg/m L系列濃度，繪制標準曲線，結果顯示，甘草酸濃度在1.0～80.0μg/m L范圍內線性關系良好，回歸方程為 y=8.55×10-5x–0.599（r=0.999 7）。

同時選定 3 個低濃度 2.0，4.0，10.0μg/m L 的標準溶液，對每一濃度水平分別重復測定6次，求出每個濃度測定結果的標準偏差s1，s2，s3，用線性回歸法作回歸曲線，求出濃度為零時空白樣品的標準偏差s0。定義3s0所對應的濃度為方法的檢出限，10s0所對應的濃度為方法的定量限，得出本方法的檢出限為 1.0mg/kg，定量限為 3.0mg/kg。

2.7 回收試驗

隨機抽取本底值為零的市售醬牛肉樣品進行加標回收試驗，每一樣品平行測定6次，結果見表2。

表2 回收試驗結果

由表2可見，該方法測定的加標回收率為95.7%～103.4%，測定結果的相對標準偏差為1.57%～3.53%（n=6）。回收率的測定結果符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[9]中表F.1中要求。

2.8 精密度試驗

隨機抽取一市售醬牛肉按1.3法進行處理，重復測定6次，測定結果為30.869 2，29.562 5，29.954 6,30.258 9，30.104 6，28.996 8 μg/m L，相對標準偏差為2.1%，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[9]中表F.3中要求。

2.9 準確度試驗

對含甘草酸濃度為 10.0，40.0，80，200.0μg/m L的溶液分別進行4次重復分析,結果見表3。結果顯示，測定含量（經回收率校正）平均值與真值的偏差為-4.7%～3.20%，符合《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[9]中表F.5中要求。

表3 準確度試驗結果

3 結語

建立了用高效液相色譜儀測定肉制品中甘草抗氧化物含量方法，該方法準確度高、靈敏度好、檢出限低、實用性強，適合于檢驗機構日常檢驗工作中大批量肉制品中甘草抗氧化物含量的測定。

[1] 徐樹蕓，王海寧.HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量[J].安徽農業科學，2008,36(24):10297-10300.

[2] 趙祎鐳,師清芝,唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取純化工藝研究[J].中國藥房,2009,20(6):426-429.

[3] GB 2760-2010食品添加劑使用衛生標準[S].

[4] ISO 11023-1999 Liquorice extracts (Glycyrrhiza glabra L.)-Determ ination of glycyrrhizic acid content - Method using highperformance liquid chromatography [S].

[5] 方從容，楊大進.保健食品中甘草酸測定方法的研究[J].中國衛生檢驗雜志,2007,17(6):986-987.

[6] 張萍，馬銀海，郭亞東等.RP-HPLP法測定果脯中甘草苷和甘草酸的含量[J].食品科學,2007,28(5):284-286.

[7] 李萍，何筱毅，周佳.炙甘草合劑中甘草酸含量測定[J].現代醫藥衛生，2009,25（10）:1 451-1 453.

[8] 胡昌江，李興華，楊婷，等.高效液相色譜法測定理中湯配方顆粒中甘草酸含量[J].中國藥業，2006,15(4):10-11.

[9] GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范 食品理化檢測[S].

Determ ination of Antioxidants Licorice in M eat by High-Performance Liquid Chromatography

Tan Botao, Hao Yuanyuan, Ding Yicong
( Fuyang Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Fuyang 236112，China )

A method for determ ination of the antioxidants licorice in meat was established. The samples were extracted by the mobile phase, separated by C18column. Methanol-0.2 mol/L ammonium acetate-acetic acid (volume ratio was 70∶29∶1) was as mobile phase w ith the fl ow rate of 1.0m L/m in. The sample was qualitatived by the retention time and quantitatived by the peak area, the detection wavelenth was 250nm. The calibration curve was linear in the range of 1.0-80μg/m L, r=0.999 7. The limit of the detection was 1.0mg/kg, the limit of quantifi cation was 3.0mg/kg, the recovery ranged from 95.7% to 103.4%and the RSD was 1.57%-3.53%（n=6）. This method is suitable for the determ ination of antioxidants licorice in meat for routine inspection work.

high performance liquid chromatography; meat; antioxidants licorice

O657.7+2；TS207.3

A

1008-6145(2012)01-0040-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.012

* 2010年安徽省質量技術監督局科技計劃項目(ZJY-018)

聯系人：郝媛媛；E-mail:446903913@qq.com

2011-10-25