液相色譜串聯質譜法測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A

顧亮，丁磊

（安徽國家農業標準化與監測中心，合肥 230051）

液相色譜串聯質譜法測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A

顧亮，丁磊

（安徽國家農業標準化與監測中心，合肥 230051）

利用液相色譜串聯質譜（LC-ESI-MS/MS）測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A。通過一系列實驗對樣品前處理條件進行了優化，樣品經乙腈提取、乙酸酸化、凈化后，采用HPLC-ESI-MS/MS檢測分析，在多反應監測模式（MRM）下，外標法定量。方法的檢出限為0.05 mg/kg，各組分濃度在0.001～0.2 mg/kg范圍內與定量離子峰面積呈良好的線性關系（r＞0.99）。平均加標回收率為61%～75%，測定結果的相對標準偏差為2.78%～4.37%(n=6)。該方法簡便、準確，各項技術指標均滿足國內外有關飼料中瘦肉精檢測要求，可用于飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A殘留的分析測定。

鹽酸克倫特羅；萊克多巴胺；沙丁胺醇；苯乙醇胺A；高效液相色譜-串聯質譜；飼料

β-受體激動劑屬于苯乙胺類藥物，能減緩或減少脂肪沉積，增加肌肉蛋白沉積，使營養重新分配，從而顯著提高動物酮體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率。因此，β-受體激動劑被大量非法用于畜牧生產，其中最常用的有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。長期食用含有β-受體激動劑殘留的食品將對人體健康產生極大的危害,可誘發和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、臉、頸部骨骼肌震顫;另外還能引起代謝紊亂，對糖尿病人可發生酸中毒或酮中毒。

近年來，一些新型的β-受體激動劑藥物被發現用于畜牧生產中，例如苯乙醇胺A等，為了保護人們的身體健康，必須從各個環節上確保畜產品的安全。開展飼料及飼料添加劑中克倫特羅和萊克多巴胺等β-興奮劑的檢測是從源頭進行控制的有效手段。因此研究飼料中克倫特羅和萊克多巴胺等β-興奮劑含量的檢測方法具有重要的意義。中國衛生部、農業部、國家藥品監督管理局發布的第176號公告（2002）和第1519號公告（2010）《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A，國際上大多數國家規定禁用這些β-興奮劑類物質。

目前檢測飼料中β-興奮劑類物質的方法主要為高效液相色譜串聯質譜法，檢測物質多為鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺，同時檢測飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A尚未見報道，因此筆者對利用液相色譜串聯質譜（LC-ESI-MS/MS）同時測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A進行了研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯質譜儀：6410Triple Quad LC/MS型，美國安捷倫公司；

離心機：Z-323 K型,德國HERMLE 公司；

氮吹儀：N-EVAP 12型，美國Organomation公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

混勻器：MS 3basic型，德國IKA公司；

去離子水發生器：M illi-Q型，美國M illipore公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色譜純，美國Tedia公司；

實驗用水：M illi-Q去離子高純水；

有機微孔過濾膜：孔徑0.22 μm；

聚丙烯離心管：50m L；

鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A標準品：德國Dr. E公司。

1.2 儀器分析條件

（1）液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（50mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：35℃；流速：0.30m L/m in ；進樣量：10μL ；流動相：0.1% 甲酸水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

（2）質譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11 L/m in；霧化器壓力：289.6 kPa（42 Psi）；毛細管電壓：4 000V ；對于所有的目標化合物，其最佳的碰撞電壓以及相應的定性離子對、定量離子對見表2。

表2 多反應監測（MRM）條件

在上述液相色譜、質譜條件下，4種β-興奮劑類物質總離子色譜圖見圖1。

圖1 4種β-興奮劑類物質總離子色譜圖

1.3 樣品前處理

（1）提取

稱取5 g粉碎試樣（精確至0.01 g）于50m L具塞塑料離心管中，加入10m L含5%甲酸的水-乙腈混合溶液（體積比1∶2），室溫下水浴超聲20m in后，以10000r/m in離心10m in，取上清液，備用。

（2）凈化

固相萃取柱（PCX）先用3 m L甲醇、3 m L水活化，將上清液過柱，依次用3 m L水、3 m L甲醇淋洗，抽干5 m in，用5%氨水甲醇溶液5 m L洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中用氮氣緩慢吹干后用流動相定容至 1.0m L，過 0.22 μm 微孔濾膜，供儀器檢測。

2 結果與討論

2.1 樣品提取條件優化

目前動物源性食品中的β-興奮劑類物質殘留檢測的提取液多為2.0mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH 5.2）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，且需要37℃恒溫水浴過夜，上述方法不適用于飼料中β-興奮劑類物質的檢測，因為飼料中的β-興奮劑類物質多為非法添加，不像動物源性食品中殘留的β-興奮劑類物質已經同動物體內的蛋白質發生軛合反應和蛋白質結合等作用。因此在選擇樣品提取溶液時沒有考慮上述提取溶劑，在參考其它文獻的基礎上選擇了5%甲酸水-乙腈作為提取溶劑，通過優化兩者之間的體積比例獲得最高回收率，實驗最終選擇5%甲酸水－乙腈（體積比1∶2）作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優化

根據β-受體激動劑苯環上取代基的差異，可分為苯胺型和苯酚型。克倫特羅屬于苯胺型結構，軛合反應率和蛋白結合率低，其余為苯酚型。由于獸藥殘留基質的復雜性，在檢測前一般需對提取液進行凈化。常見的凈化技術主要是液-液分配和固相萃取，其中液-液分配對苯胺型凈化效果較好，但由于苯酚型極性相對較高，回收率低，因此實驗采用混合型固相萃取柱PCX－固相萃取凈化樣品。

2.3 儀器條件的選擇

在LC-MS/MS分析中，色譜的分離和質譜數據的采集是同時進行的，為了使每個組分都能得到分離和鑒定，以獲得最大的靈敏度，必須設置合適的色質分析條件，特別是質譜條件。

色譜條件包括色譜柱類型、流動相組成、流動相大小、柱溫等。質譜條件包括離子源、離子化模式、離子源溫度、霧化氣流量、質量掃描范圍、定量檢測模式等，這些都要根據樣品情況進行設定。通過試驗優化的儀器分析條件見表1、表2。

2.4 工作曲線方程與檢出限

在優化條件下，配制一系列不同濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分定量離子的峰面積對濃度繪制標準曲線，線性關系和相關系數見表3。結果表明，在 0.001～0.2 mg/kg 范圍內，4 種 β-興奮劑類物質的質量濃度（X）與定量離子的峰面積（Y）呈良好的線性關系。對不含瘦肉精的空白樣品進行測定，以10倍信噪比計算方法的檢出限為0.05mg/kg。

2.5 精密度和回收試驗

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，分別

表3 工作曲線方程、線性范圍、相關系數、檢出限

對不同飼料樣品中4種β-興奮劑類物質進行5個水平的添加回收試驗，每個水平進行6次重復試驗，試驗結果見表4。由表4可知，回收率為61%～75%，6次測定結果的相對標準偏差為2.78%～4.37%。

表4 回收試驗結果(n=6)

3 結語

建立了液相色譜串聯質譜（HPLC-ESI-MS/MS）法，并快速、準確地測定了飼料中4種β-興奮劑類物質殘留量。該方法具有快速、靈敏、準確和操作簡單的特點，能夠很好地應用于各種飼料中β-興奮劑類物質的分析檢測。

［1］Yang Y T，Ecellgo tt M a.M u ltip le action o f ad renergic agonistsonskeletal muscle and adipose tissue[J]. Biochem istry，2000，261:1-10.

［2］Li Junsuo，Qiu Yuem ing，Wang Chao. Residue analysis for veterinary drug[M].Shanghai：Shanghai Scientific & Technical Publishers，2002:641-658.

［3］高燕紅，吳西梅.液質聯用快速測定飼料中的萊克多巴胺和克倫特羅 [J].中國衛生檢驗雜志，2005，15 (6):643-645.

Determ ination of Clenbuterol Ractopam ine Salbuterol and Nylethanolam ine in Feeds by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem M ass Spectrometry

Gu Liang，Ding Lei
（National Center of Agricultural Standarlization and Supersion，Hefei 230051，China）

A new method was developed for the determ ination of clenbuterol, ractopam ine, salbuterol and phenylethanolam ine A by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.Sample preparation and HPLC-MS/MS analytical conditions were examined and optimized critically by use of a series of experiments study. Samples were extracted by acetonitrile，then cleaned up，and analyzed qualitatively and quantitatively by LC-ESI-MS/MS. The method detection lim it （LOD）was 0.05 mg/kg. Element concentration was linear w ith peak area in the range of 0.001-0.2 mg/kg（r ＞ 0.99）. The average recoveries ranged from 61% to 75%. The method is simple，effi cient，accurate and can meet the requirements of determination for clenbuterol，ractopamine，salbuterol and phenylethanolamine A in feeds.

clenbuterol; ractopam ine; salbuterol; phenylethanolam ine A; liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; feed

O657.99

A

1008-6145(2012)01-0037-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.011

聯系人：丁磊；E-mail:dinglei8@126.com

2011-10-12