EMA－LAMP方法快速檢測鑒別副溶血性弧菌

金雪花，呂淑霞，張超，徐彬，于曉丹

(沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種常見腸道致病菌，其污染會給海水養殖業帶來嚴重損失，還會引起人類腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭痛等癥狀［1］。自2001年以來，副溶血弧菌性食物中毒爆發已經成為中國最常見的食源性疾患。隨著人們對食品安全性要求的不斷提高，對細菌的“活的非可培養狀態”(Viable but non-culturable state，VBNC)進行檢測研究的實際意義越來越明顯。常規的基于分子水平檢測病原菌的方法以其具有快捷、靈敏、特異性強等優點已用于副溶血性弧菌及其他致病菌的檢測研究［2］，但是其缺點在于不能區分所檢測到的病原菌是活細胞還是死細胞，而且由于需要精密度高的儀器而限制了其在現場和基層單位的應用［3］。近年來環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其高效、靈敏、操作方便等優點，使其在食源性致病菌以及病毒的檢測中得到了重要的應用［4-6］。LAMP檢測法無需精密度高的儀器，僅需在恒溫條件下便可完成核酸擴增反應［7］，是一種可實現現場和基層單位應用的方法。Thidium Bromide Monoazide(EMA)作為一種DNA結合染料，易光解形成氮賓化合物且能滲透到細胞壁(膜)不完整的菌體內，與DNA分子不可逆的共價結合，從而抑制死細胞的DNA擴增。因此，EMA與PCR、LAMP結合檢測鑒定副溶血性弧菌的死/活細胞具有一定的可行性。目前，已有EMA與PCR、LAMP相結合，成功抑制死細胞的擴增且對混合菌中活細胞進行定量檢測的報道［8-10］。本試驗將具有選擇滲透性的EMA與高效、靈敏的LAMP相結合，在純培養條件下，對副溶血性弧菌的死/活菌細胞進行檢測及鑒別，從而建立了EMA-LAMP檢測法，并將此方法與EMAPCR法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，ATCC 17802)購自北京中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑LAMP體系有關試劑:Bst DNA聚合酶(8 U/μL)、1×ThermoPol buffer Biolabs;Betaine Fluka;MgSO4;PCR體系有關試劑:Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs、10×Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)、LoadingBuffer TAKARA公司;DL1000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker上海生物工程有限公司;5×TBE電泳緩沖液:稱取Tris 54.0 g、硼酸27.5 g，并加入0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)20.0 mL，定容至1 000 mL。用時稀釋到1.0×TBE電泳緩沖液(pH 8.3);EB母液:將EB配制成10.0 mg/mL，用鋁箔或黑紙包后貯于室溫，使用前稀釋;EMA母液:無菌水溶解EMA，配制成1.0 mg/mL母液，用錫箔紙包裹置于－20℃備用。

1.1.3 主要儀器恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;PCR儀，TECHNE公司;JY600C型電泳儀，北京君意東方電用儀器有限公司;凝膠成像系統，伯樂公司;移液槍，Eppendorf;500W鹵鎢燈，沈陽藝沈器化玻站。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成根據GenBank公布的副溶血性弧菌tlh基因序列(Accession number:AY 289609)中的保守序列，運用引物設計軟件(Primer Explorer V4)在線進行LAMP引物設計，設計1套引物，包括2條外引物F3、B3，2條內引物FIP、BIP和2條環引物LF、LB。為了更有好地進行EMA-PCR與EMA-LAMP法檢測副溶血性弧菌的優劣對比，本文用LAMP反應中的1對外引物F3、B3分別作為PCR擴增反應中的上游引物和下游引物參與反應，PCR擴增片段為231 bp。以上引物由TAKARA公司合成。引物序列見表1。

表1 擴增tlh基因的LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers for specific amplification of the tlh gene(Accession number:AY289609)

1.2.2 DNA模板制備TZ法［11］:取0.5 mL對數期菌懸液與等體積的2×TZ的細胞裂解液混勻，沸水浴10 min后冷卻到室溫，10 000 r/min離心5 min去掉沉淀，取上清液備用;TZ裂解液配置:2.0%Triton X-100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0。

1.2.3 熱處理殺死副溶血性弧菌取10.0 mL 37℃培養至對數生長期的副溶血性弧菌菌懸液，用無菌的胰胨肉湯稀釋，使菌濃度為1.0×108cfu/mL。取以上處理的0.5 mL菌懸液于1.5 mL離心管中，參考祝儒剛等［1］的研究，直接將菌懸液在95℃水浴處理10 min，待菌懸液冷卻至室溫，涂平板，置于37℃培養箱中培養24 h，觀察計數。

1.2.4 不同濃度EMA對死菌細胞DNA擴增的影響取0.5 mL濃度為1.0×108cfu/mL的熱致死的副溶血性弧菌菌懸液，加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗用液，使EMA終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，混勻并于黑暗下室溫放置5 min后放在冰浴上，每5 min補充1次碎冰塊，距500 W鹵鎢燈16 cm，根據文獻［12］暫定曝光時間為30 min。然后10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 mL生理鹽水，再10 000 r/min離心10 min，棄上清后加入0.5 mL無菌水。按照1.2.2中的方法抽提DNA進行LAMP和PCR擴增檢測。

1.2.5 不同濃度EMA對活菌細胞DNA擴增的影響取0.5 mL濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活細胞菌懸液，加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗用液，使EMA終濃度分別為0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，進行光照及光照后處理，同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進行LAMP和PCR擴增檢測。

1.2.6 EMA最佳曝光時間的確定取0.5 mL熱致死的副溶血性弧菌菌懸液(濃度為1.0×108cfu/mL)加入8個1.5 mL離心管中，每管加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗用液，使其終濃度為上述優化好的最小抑制死細胞擴增的濃度，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離500 W鹵鎢燈燈管16 cm，分別進行0、1、5、10、15、20、25、和30 min的光照，每5 min補充1次冰，防止溫度升高。光照后處理同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進行LAMP和PCR擴增檢測。同樣方法取活菌菌懸液進行EMA-LAMP和EMA-PCR作為對照。

1.2.7 EMA-LAMP和EMA-PCR擴增混合菌中活菌細胞DNA的比較試驗分3組進行對照分析。A組為0.25 mL熱殺死細胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經無菌胰胨肉湯10倍比例稀釋的活細胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中，進行LAMP和PCR擴增。陽性對照為0.5 mL含有1.0×108cfu/mL的活細胞菌懸液;B組為0.25 mL經無菌胰胨肉湯進行10倍比例稀釋的活細胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)分別混合于0.25 mL無菌水，進行LAMP和PCR擴增。陽性對照同上;C組為0.25 mL活細胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經無菌胰胨肉湯10倍比例稀釋的不同濃度(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的熱殺死菌細胞懸液中。進行LAMP和PCR擴增。陽性對照同上。以上3組分別加入EMA溶液，使其終濃度為最小抑制死細胞擴增的濃度，黑暗下室溫放置5 min后，進行光照及光照后處理。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進行LAMP和PCR擴增檢測。

1.2.8 LAMP反應體系及反應條件MgSO42 mmol/L，dNTPs 1.0 mmol/L，betaine 1.0 mol/L，內引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，環引物(LF和LB)各0.8 μmol/L，Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μL)0.8 μL，1×ThermoPol Reaction buffer 2.5 μL，DNA模板1 μL，補水至反應體系25 μL;混勻，于63℃溫育30 min，80℃滅活10 min，冰浴2 min。

1.2.9 PCR反應體系及反應條件配制PCR反應體系:dNTPs 0.8 mmol/L，引物各0.8 μmol/L，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(含Mg2+)2.5 μL，DNA模板2.0 μL，補水至反應體系25.0 μL。;反應條件:預變性94℃，3 min;然后按94℃，1 min，59℃，1 min，72℃，2 min循環30次;最后1個循環結束后，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.10 擴增產物分析取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度1%，電壓100 V)，電泳后用溴化乙錠染色及UVI凝膠成像系統觀察分析結果。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取DNA的LAMP擴增

圖12 種方法提取模板DNA的LAMP擴增Fig.1 Two methods of DNA extraction for amplification by LAMP(A，B)M:DL1000 Marker;1:陰性對照;2:煮沸法提取DNA;3:TZ法提取DNA

按照1.2.2中的方法提取DNA，進行LAMP擴增，結果見圖1。從圖1中可以看出，2種方法提取的DNA進行LAMP擴增后，擴增結果并無明顯區別。因此，在之后的試驗中，選擇簡便、快捷、成本低的煮沸法提取DNA。

2.2 熱處理殺死副溶血性弧菌

將濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活細胞放入95℃水浴10 min做熱殺死處理，經平板培養計數得:在此條件下可以完全殺死菌此濃度的副溶血性弧菌活細胞。

2.3 不同濃度EMA對死菌細胞DNA擴增的影響

設定EMA的濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。由圖2A可知，當EMA濃度為6.0 μg/mL時，LAMP擴增結果仍有非常隱約的條帶產生，而當其濃度大于等于8.0 μg/mL時，無條帶產生，說明LAMP擴增被抑制;由圖2B可知，當EMA濃度小于等于2.0 μg/mL時，PCR擴增條帶亮度隨EMA濃度的增加而減弱，濃度大于等于4.0 μg/mL時，無條帶產生，說明PCR擴增被抑制。

圖2 不同濃度EMA對死菌DNA擴增的影響Fig.2 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from heat killed bacterial cells

2.4 不同濃度EMA對活菌細胞DNA擴增的影響

設定EMA的濃度為0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL。由圖3A可知，擴增條帶并未隨著EMA濃度的增加而減弱，而是呈現出亮度幾乎無差別的情況，說明不同濃度的EMA對活菌細胞DNA進行LAMP擴增無影響，或者影響不大;由圖3B可知，當EMA濃度小于等于20 μg/mL時，PCR擴增條帶亮度隨EMA濃度的增加而有所減弱，當EMA濃度達到40 μg/mL以上時，無條帶產生，說明高濃度EMA對活菌細胞DNA的PCR擴增有抑制作用。

2.5 EMA最佳曝光時間的確定

根據2.3和2.4的優化結果，此處的試驗選擇加入EMA的濃度為最小抑制副溶血性弧菌死細胞的EMA濃度，即8.0 μg/mL。從圖4A、B、C、D可以看出，經此濃度的EMA處理后的活菌，無論曝光多長時間，對LAMP和PCR擴增均無影響;經此濃度的EMA處理后的死細胞，曝光時間為20 min時，PCR便沒有擴增條帶，而LAMP仍有擴增條帶，雖然條帶亮度有所減弱，仍可說明沒有完全抑制LAMP擴增;當曝光時間大于等于25 min時，PCR與LAMP對死細胞的擴增結果為均無擴增條帶產生。表明，無論應用哪種方法對副溶血性弧菌死/活細胞進行檢測鑒定，EMA光解時間超過25 min，便能夠達到區分死/活菌細胞的目的。

圖3 不同濃度EMA對活菌DNA擴增的影響Fig.3 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from viable bacterial cells

圖4 EMA激活光解的最佳曝光時間的確定Fig.4 Determination of light exposure time to activate and photolyse EMA

2.6 EMA-LAMP和EMA-PCR擴增混合菌中活菌細胞DNA的比較

3組EMA-LAMP擴增試驗結果見圖5A、C、E;3組EMA-PCR擴增試驗結果見圖5B、D、F。結果表明，0.25 mL熱殺死細胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經無菌胰胨肉湯進行10倍比例稀釋的活細胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的擴增結果，與經上述相同處理的活細胞菌懸液分別混合于0.25 mL無菌水的擴增結果基本一致，擴增條帶的亮度隨著活菌數量的減少而減弱(圖5A、C;B、D)。而且，從圖5A中可得EMA-LAMP的檢出限為1.0×102cfu/mL，從圖5B中可得EMA-PCR的檢出限為1.0×105cfu/mL，說明EMA-LAMP檢測靈敏度要高于EMA-PCR。圖5E、F為0.25 mL活菌細胞懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經無菌胰胨肉湯進行10倍比例稀釋的熱殺死細胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中進行LAMP和PCR擴增的結果。從圖5可以看出，LAMP與PCR擴增條帶的亮度并無明顯區別，表明不同數量熱致死菌的LAMP與PCR擴增均被抑制。

圖5 EMA-LAMP和EMA-PCR擴增混合菌中活菌細胞的DNAFig.5 EMA-LAMP and EMA-PCR amplitication of the viable cells from a mixture of viable and dead cells

3 討論

用EMA檢測細菌的VBNC雖然有諸多優點，但研究發現一定濃度的EMA也會對活細胞產生毒副作用［13］，可抑制活細胞DNA擴增，因此使其應用也受到較大的限制。EMA毒副作用與菌液溫度和EMA曝光時間有關。因為溫度對細菌細胞膜的滲透性和流動性有一定的影響［14］。因此，曝光時要放在冰上，防止升溫，且需要對EMA最佳曝光時間進行摸索。在擴增混合菌時，進行多次離心去掉EMA，防止除了進入死菌細胞外的多余EMA對活菌細胞產生毒副作用。

疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)作為一種高親和力光解DNA染料，結構和作用類似于EMA。PMA能夠與細菌死細胞的DNA共價結合并抑制其PCR反應，使得PCR只能夠檢測到細胞膜完整的細菌活細胞，而無法檢測到細胞外DNA和細胞膜破損的細菌死細胞。將EMA和PMA穿透活細胞細胞膜的能力進行比較，發現雖然EMA能穿透厭氧菌的細胞膜，但是會造成DNA損失，與此相比，PMA的優勢在于無法穿透厭氧菌的細胞膜。研究發現EMA不僅抑制死細胞擴增，也能降低活細胞擴增效率，而PMA只能選擇性抑制死細胞PCR擴增。雖然，PMA-PCR檢測細菌活的非可培養狀態逐漸變成當前研究的熱點，但是有實驗表明PMA抑制死菌擴增的用量要大于EMA，而且價錢比EMA高。所以，目前主要還是應用EMA與PCR等技術結合進行死/活細胞的鑒定。但無論是應用EMA還是PMA，該方法都是結合了EMA(PMA)選擇滲透性和PCR特異性，作為一種區分細胞死活的方法，可以在一定程度上有效檢測細菌VBNC細胞。

本試驗針對副溶血性弧菌種特異性基因tlh作為檢測的靶基因，采用了一種將DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)與LAMP結合的分析方法，對濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活細胞、熱殺死細胞和死活混合細胞進行了檢測，并與EMA-PCR相比較，結果如下:①采用煮沸法和TZ法提取DNA作為LAMP擴增的模板，發現2種方法擴增的條帶亮度基本無差距，說明采用不同的提取DNA的方法進行LAMP擴增無影響;②EMA濃度對副溶血性弧菌活菌LAMP擴增幾乎無影響，而抑制PCR擴增的最大EMA濃度為40 μg/mL;③抑制副溶血性弧菌死細胞LAMP擴增的最小EMA濃度為8.0 μg/mL，抑制死細胞PCR擴增的最小EMA濃度為4.0 μg/mL。表明，EMA-LAMP抑制死細胞所用的EMA濃度大于EMA-PCR，也就是說EMA-LAMP更能保證檢測的靈敏度與準確性;④選擇8.0 μg/mL的EMA檢測1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活細胞，確定EMA激活光解進入死細胞中且與DNA結合的最佳曝光時間至少為25 min;⑤在用EMA-LAMP和EMA-PCR擴增混合菌中活菌細胞DNA檢測中，將相同濃度的熱殺死細胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于不同濃度的活細胞菌懸液中(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的擴增結果與上述活菌細胞懸液混合無菌水的EMALAMP(EMA-PCR)擴增結果基本一致，說明EMALAMP和EMA-PCR能夠有效區分混合菌中的活細胞，且EMA-LAMP的檢出限為1.0×102cfu/mL，EMA-PCR的檢出限為1.0×105cfu/mL，再次證明EMA-LAMP的檢測靈敏度優于EMA-PCR;⑥將相同濃度的活菌細胞懸液(1.0×108cfu/mL)混合于不同濃度的熱殺死細胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的EMA-LAMP和EMAPCR擴增條帶的亮度并無明顯區別，表明不同數量熱致死菌的LAMP(PCR)擴增均被抑制。

［1］ 祝儒剛，呂淑霞，劉月萍，等.基于DNA染料EMA的PCR技術檢測鑒別副溶血性弧菌死活細胞［J］.食品與發酵工業，2010，36(7):144-149.

［2］ 張如勝，宋克丟，蘇良，等.環介導等溫擴增技術快速檢測副溶血性弧菌［J］.國際檢驗醫學雜志，2009，30(3):217-219.

［3］ M.M.Parida，S.R.Santhosh，P.K.Dash，et al.Development and evaluation of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and Real-Time setection of Japanese Encephalitis Virus［J］.Journal of Clinical Microbiology，2006，44(11):4172-4178.

［4］ 朱勝梅，吳佳佳，徐馳，等.環介導等溫擴增技術快速檢測沙門菌［J］.現代食品科技，2008，24(7):725-730.

［5］ Siyi Chen，Beilei Ge.Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus［EB/OL］.http://www.biomedcentral.com/1471-2180/10/41.

［6］ Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28(12):E63.

［7］ Lee JL，Levin RE.Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA，sodium deoxycholate and real-time PCR［J］.Journal of Microbiological Methods，2009，79(2):184-188.

［8］ Pan Y，Breidt F，Jr.Enumeration of Viable Listeria monocytogenes Cells by Real-Time PCR with Propidium Monoazide and Ethidium Monoazide in the Presence of Dead Cells［J］.Appl.Environ.Microbiol，2007，73(24):8028-8031.

［9］ Chang B，Sugiyama K，Taguri T，et al.Specific detection of viable Legionella cells by combined use of photoacti-vated ethidium monoazide and PCR/Real-Time PCR［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(1):147-153.

［10］ A.Abolmaaty，C.Vu，J.Oliver，et al.Development of a new lysis solution for releasing genomic DNA from bacterial cells for DNA amplification by polymerase chain reaction［J］.Microbios，2000，101:181-189.

［11］ 李月，王麗，孫遠明，等.DNA染料結合環介導等溫擴增技術檢測志賀氏菌死活細胞［J］.食品工業科技，2011，32(8):216-219.

［12］ Soejima T，lida K，Qin T.Photoactivated ethidium monoazide directly cleaves bacterial DNA and is applied to PCR for discrimination of live and dead bacteria［J］.Microbiol Immunol，2008，51(8):763-775.

［13］ Mesbah N M，Wiegel J.Life at extreme limits the anaerobic halophilic alkali thermophiles［J］.Ann.N.Y.Acad.Sci，2008，1125:44-57.

［14］ Nocker A，Mazza A，Masson L，et al.Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology［J］.Journal of Microbiological Methods，2009，76(3):253-261.