IL－23在鼻息肉中的表達及其意義

丁國臣，王亞輝，司 迎，王 艷，曹志偉

IL－23在鼻息肉中的表達及其意義

丁國臣1，王亞輝1，司 迎2，王 艷1，曹志偉3

目的檢測IL－23在鼻息肉(nasal polyp，NP)組織中的表達，探討其在鼻息肉發病中的作用。方法收集15例鼻息肉標本(NP組)和15例在鼻中隔偏曲矯正手術中根據需要部分切除下鼻甲黏膜組織(對照組)，分別采用免疫組織化學方法和RT－PCR方法檢測兩組IL－23蛋白和IL－23p19mRNA表達水平。結果NP組IL－23蛋白陽性表達炎性浸潤細胞數明顯多于對照組，單位目標面積光密度均值(0.321±0.023)明顯高于對照組(0.199±0.011)，差異有統計學意義(P＜0.01);IL －23p19mRNA 表達水平 (0.676±0.077)明顯高于對照組(0.212±0.015)，差異有統計學意義(P ＜0.01)。結論IL－23可能在參與了NP發病過程。

白細胞介素23;鼻息肉;免疫組化;逆轉錄聚合酶鏈反應

R765.22

鼻息肉(nasal polyp，NP)作為上氣道黏膜慢性炎性反應的一部分，其發病機制與過敏性鼻炎、哮喘等極為相似，被公認為是“同一氣道，同一疾病”［1］。研究發現，IL－23/IL－17軸更能科學地闡明慢性炎性反應性疾病的發病機制［2，3］。該學說認為，由炎性反應細胞產生的IL－23刺激Th0細胞，向一種新的Th細胞亞型－Th17細胞分化，Th17細胞產生炎性反應性細胞因子IL－17，后者具有強烈的致炎作用，從而導致多種炎性反應的發生。本研究于2010－06至2010－12通過檢測IL－23在NP中的表達，探討IL－23在NP發病中的作用，以期為IL－23/IL－17軸在鼻息肉中的作用機制提供理論依據，并為重新認識NP的發病過程和制訂治療策略提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院鼻息肉手術患者的鼻息肉組織(NP組)15例，男9例，女6例，年齡20～55歲，平均(39.50±3.21)歲;選取同期接受鼻中隔偏曲矯正術，且根據病情需要部分切除下鼻甲黏膜組織的患者15例作為對照組，男7例，女8例，年齡21～49歲，平均(35.70±2.95)歲。兩組患者術前嚴格進行過敏性疾病問卷調查，均無多發性噴嚏、流水樣鼻涕，或發作性喘息等過敏性疾病史，術前4周內均未接受過類固醇激素、抗組織胺類藥物治療及免疫治療。

1.2 標本處理 標本取材后平分為兩份，一份立即浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，另一份立即投入液氮中冷凍保存。

1.3 主要試劑 兔抗人IL－23抗體(產品編號:bs－1193R)、SP試劑盒(通用型)、DAB顯色試劑盒均由北京博奧森生物科技有限公司提供。總RNA提取試劑(Trizol)由invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq酶、DL2000 DNA marker由北京康為世紀生物科技有限公司提供。引物由北京三博遠志生物科技有限公司合成。

1.4 免疫組織化學方法 采用SP法，染色步驟按照試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，光鏡下觀察陽性細胞。在清晰的背景上出現特異性棕黃色顆粒者為陽性，陰性對照無特異性著色。

灰度值測定:切片染色后，選擇染色良好區域，應用Leica Q550CW圖像采集和分析系統，每份標本選擇3張染色較好切片進行觀察，每張切片在顯微鏡下(40×10)選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值作為其表達情況，取均值作為該份標本IL－23蛋白的表達水平。

1.5 RT－PCR 用Trizol一步法提取總RNA。取1 μg總RNA用M－MLV反轉錄酶將其反轉錄為cDNA。IL－23p19mRNA的上游引物:(s)上游引物為:5'－ GAGCAGCAACCCTGAGTCCCTA －3'，下游引物為:5'－CAAATTTCCCTTCCCATCTAATAA －3'，擴增片段長度為230 bp。內參基因GAPDH上游引物:5'－TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG －3'，下游引物:5'－CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC－3'，擴增片段長度為287 bp。擴增條件為94℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環;進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后取出凝膠，在波長為254 nm的紫外燈下觀察，并在凝膠成像系統中拍照、保存，計算平均光密度比值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件，計量資料以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IL－23p19mRNA表達水平 RT－PCR檢測顯示，NP組 IL－23p19mRNA相對表達水平為(0.676 ± 0.077)，明顯高于對照組 (0.220 ±0.015)，兩組差異有統計學意義(P ＜0.01)。

2.2 IL－23蛋白表達水平 對照組鼻黏膜中幾乎沒有IL－23陽性細胞存在(圖1A)，NP組鼻息肉組織中可見大量IL－23陽性的炎性細胞浸潤(圖1B)。NP組IL－23蛋白相對表達水平(0.821±0.023)明顯高于對照組(0.199 ±0.011)，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 人鼻息肉中IL－23的陽性表達(SP×400)

3 討 論

目前，NP確切的發病機制仍然不清楚，被公認為是一種多致病因素參與的疾病實體，這些因素包括鼻腔鼻竇解剖結構異常、感染與非感染性炎性反應、免疫異常、遺傳因素等。關于NP發病過程，有多種學說解釋，包括自主神經功能失調、離子通透性改變、氣流動力學說、感染學說和變態反應學說等。隨著分子生物學研究領域的進展，變態反應(allergic reaction，AR)及感染導致的炎性反應學說越來越受到重視。白細胞介素作為細胞因子在鼻息肉發病中也發揮了重要作用，如 IL －1、3、4、5、6、8 等［4，5］。

IL－23是2000年發現的白細胞介素12家族成員，其主要結構由p19和p40兩個亞單位組成，其中，p40與IL－12中的p40具有同源性，人和小鼠活化的樹突細胞(DC)、巨噬細胞(Mφ)、T細胞和內皮細胞都能產生IL－23，但最主要由活化的DC產生［6］。IL－23的主要生物學功能是調解新的CD4+T細胞亞群(Th17細胞)產生IL－17，形成IL－23/IL－17軸而在自身免疫疾病、慢性炎性反應性疾病中發揮重要作用［7－10］。IL－23通過此途徑與多種自身免疫性炎性反應性疾病有關，并在局部組織重塑過程中起要作用，如自身免疫性腦脊髓膜炎、類風濕關節炎、牛皮癬、支氣管哮喘等［11－13］。IL －23 在過敏性鼻炎鼻黏膜中存在高表達［14］，但在NP中的表達狀態還不清楚。

本研究結果表明，IL－23在NP中表達明顯增高，說明IL－23可能參與了NP的發病過程，但其具體機制尚不清楚。深入研究NP中IL－23與其他白細胞介素家族成員的作用機制，將為認識NP發病機制提供一條新的途徑，同時，針對IL－23的治療，可能會成為治療NP的一個新靶點。

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Expression of IL－23 in nasal polyps and its significance

DING Guochen1，WANG Yahui1，SI Ying2，WANG Yan1，and CAO Zhiwei3.1.Liaoning Provincial Corps Hospital;2.Liaoning Provincial Corps Department of Public Health，Chinese People’s Armed Police Forces，Shenyang110034，China;3.Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China

ObjectiveTo investigate the expression and role of interleukin－23(IL－23)in nasal polyp patients.Methods NP tissues of 15 nasal polyp(NP)patients and 15 simple deviations of normal inferior turbinate tissues of nasal septum patients were collected.mRNA and protein expression of IL－23 were detected by means of immunohistochemistry and RT－PCR.Results Immunohistochemistry staining demonstrated that there were far more IL－23 positive cells in NP patients than in normal controls.The average expression level of IL －23 protein in NP tissues(0.321 ±0.023)was significantly different(P ＜0.01)from that of normal inferior turbinate tissues(0.199±0.011).RT －PCR demonstrated that the average expression level of IL －23p19mRNA in NP tissues(0.676 ±0.077)was significantly different(P ＜0.01)from that in normal inferior turbinate tissues(0.212 ±0.015).Conclusions IL－23 may be involved in the chronic inflammation of NP.

interleukin－23;nasal polyp;immunohistochemistry;RT－PCR

丁國臣，男，1977年出生。碩士，主治醫師。主要從事耳鼻喉科臨床工作。

1.110034 沈陽，武警遼寧總隊醫院耳鼻喉科，2.110034沈陽，武警遼寧總隊衛生處;3.110004 沈陽，中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科

(2012－01－06收稿 2012－07－19修回)

(責任編輯 尤偉杰)