組織塊貼壁法培養人腸系膜動脈平滑肌細胞的研究

國強華，宋維鵬，王慶勝，劉 麗

組織塊貼壁法培養人腸系膜動脈平滑肌細胞的研究

國強華1，宋維鵬2，王慶勝1，劉 麗1

目的采用組織塊貼壁法建立成人腸系膜動脈血管平滑肌細胞體外模型，為心血管疾病研究提供實驗基礎。方法運用組織塊貼壁法對成人腸系膜動脈平滑肌細胞進行原代培養，用倒置顯微鏡和免疫組化進行細胞形態學觀察和鑒定。結果運用組織塊貼壁法成功獲得大量單個成人腸系膜動脈平滑肌細胞，培養的細胞呈典型“峰－谷”樣生長，免疫組化顯示胞漿內平滑肌肌動蛋白陽性表達。經胰酶消化后可傳20代。結論通過組織塊貼壁法可以獲得成人動脈平滑肌細胞(human vascular smooth muscle cell，hVSMC)，為心血管疾病的實驗研究提供良好的材料。

人;腸系膜動脈;平滑肌;細胞培養

動脈中膜的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在心血管疾病發生中具有重要作用。研究表明，高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等多種疾病的病理過程常伴有VSMC的舒縮、遷移、增殖和纖維化。動脈血管平滑肌細胞的培養已經被廣泛用于心血管疾病發病機制的研究［1－3］。目前，國內外大多數實驗室仍選用動物的動脈作為血管平滑肌細胞體外培養的來源［4，5］，很少采用成人動脈。盡管動物的血管平滑肌細胞較容易培養，但其生物學特性與人的血管平滑肌細胞存在不少的差異，特別是在基因表達、抗原特異性方面，據此得出的實驗結果并不能準確反映人體的實際情況。本實驗旨在通過組織塊貼壁法建立穩定的成人動脈血管平滑肌細胞體外培養模型［6，7］，為開展相關實驗打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑及液體配置 DMEM/F12干粉(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)、EDTA(Boehringe公司)、青霉素、鏈霉素、生理鹽水、PBS緩沖液、DHank’s液、25 ml塑料培養瓶(Coming公司)、抗平滑肌Actin單克隆抗體和免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物公司)。將培養液配成含20%胎牛血清的DMEM/F12培養液，每毫升中加入100 U青霉素和100 μg鏈霉素，調 pH值為7.0;100ml DHank液中加0.25 g胰蛋白酶和0.125 g EDTA配成濃度為0.25%胰酶和0.0125%EDTA的混合溶液，調pH值為8.0。配好的試劑分裝后－20℃冰箱中保存備用。

1.2 成人腸系膜動脈的分離 選擇腹部外科手術中摘除的腸系膜動脈［供體年齡為(50±5)歲，無高血壓及器質性心血管疾?。?，該醫療行為得到秦皇島市第一醫院倫理委員會的許可。手術室中分離切取人腸系膜動脈5～8 cm，用生理鹽水將血管內外的血跡反復沖洗干凈，移入含20%胎牛血清的無菌DMEM/F12培養液中。

1.3 VSMC的原代培養 實驗室超凈臺內，在PBS平衡液的無菌培養皿內，用眼科鑷去除血管外膜及結締組織，露出白色的中膜，放入另一無菌培養皿中，縱向剪開血管，將血管內壁沖洗數次，用無菌棉花輕輕擦拭數次以除去內膜只留取中膜，眼科鑷夾取中膜組織，用1 ml含20%胎牛血清的DMEM/F12培養液反復沖洗后，放入另一無菌培養皿中，滴少許含20%胎牛血清的DMEM/F12培養液，用眼科剪剪成1 mm的小塊，用彎頭吸管將小塊移入25 ml培養瓶內，以3～5塊/cm2密度均勻貼于培養瓶底，培養瓶底內加入1 ml含20%胎牛血清的無菌DMEM/F12培養液，緩慢豎直培養瓶，以培養液剛未浸沒小塊為宜，放至5%CO2、37℃培養箱干涸2～4 h后輕輕翻轉，使小塊剛好浸入培養液中，原代培養每3 d換1次液，待4～5周細胞長滿培養皿后即可傳代。

1.4 VSMC的傳代培養 傳代前1 d換液1次，傳代時棄去原培養液，PBS輕輕沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.0125%EDTA的混合溶液2 ml，培養箱中消化90 s，鏡下觀察見細胞收縮變圓、間隙增寬，立即加入新鮮培養液4 ml終止消化，用彎頭吸管將細胞均勻吹打下來，離心后制成細胞懸液，細胞計數板計數達到107個/ml，調整細胞濃度為105個/ml，按1∶2傳代，每3 d換液1次，傳代周期為6～9 d。

1.5 形態學觀察及細胞鑒定

1.5.1 形態學觀察 應用相差顯微鏡觀察細胞大小、形態、生長特點及排列方式等。

1.5.2 免疫細胞化學染色 將第3代細胞胰蛋白酶消化后以105個/ml的細胞濃度接種于置有蓋玻片的6孔培養板中培養，待細胞長至60%后取出細胞爬片，PBS清洗5次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定20 min，再PBS沖洗5次，每次5 min，然后用抗平滑肌Actin單克隆抗體進行免疫細胞化學染色，以VSMC胞質出現棕黃色為陽性結果，同時計數陽性百分率。

2 結 果

2.1 體外培養生長情況 原代成人腸系膜動脈平滑肌細胞貼壁牢固，3～4周后細胞呈充分伸展梭型，4～5周后即可傳代，傳代后12 d即可貼壁，4～5 d可出現VSMC特有的“峰－谷”樣生長，這是平滑肌特征性生長表現(圖1)。

圖1 hVSMC細胞體外培養生長情況

2.2 形態學觀察和鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞形態，未貼壁前細胞呈圓形或橢圓形，胞質密度高，不透明，胞核多為卵圓形，有多個核仁;貼壁后細胞胞質透明，彼此融合在一起，細胞呈梭形或多角形，核居中央，呈橢圓形(圖2)。免疫組織化學檢測平滑肌α－肌動蛋白表達呈陽性顯示，細胞計數陽性率為98%。

圖2 hVSMC細胞免疫組織化學鑒定反應產物呈棕黃色(×200)

3 討 論

研究血管平滑肌細胞的生物學行為是且前探討動脈粥樣硬化發生發展的熱點之一［6，7］，然而成人的血管平滑肌細胞(hVSMC)培養難度很大，目前大多數的實驗室仍用較易培養的動物血管平滑肌細胞來代替hVSMC，但鑒于其生物學特性與人源細胞存有一定差異，特別是在基因表達、抗原特異性方面，故使用人的血管平滑肌細胞成為許多心血管疾病研究的理想材料［1，8］。

本實驗成功地建立了用人的腸系膜動脈培養血管平滑肌細胞的體外模型，培養的平滑肌細胞呈典型“峰－谷”樣生長，免疫組化顯示胞漿內平滑肌肌動蛋白陽性表達。組織塊貼壁法簡單、經濟，經過一定時間的初步訓練，即可掌握相關的無菌操作和技術。本實驗需注意以下幾點:(1)培養液。選用DMEM/F12培養液，因其內Ca2+和Mg2+含量高，營養豐富并含有利于細胞生長的因子及成分，保證成人血管平滑肌細胞在體外培養生長良好。培養液配置時的pH值應在7.0左右，因為hVSMC耐酸不耐堿，在稍微偏酸性的環境下生長的比較好。(2)血清。胎牛血清比小牛血清好，原代培養時用20%(v/v)胎牛血清，傳代培養時可改用l0%(v/v)胎牛血清。(3)組織塊。不應剪切過小，1 mm2最合適，否則組織塊損傷大，水分容易喪失，導致原代培養失敗。組織塊間距需2～3 mm，以保證細胞從組織塊游出后有足夠的生長空間并保持局部細胞密度的均勻，從而獲得更多的原代細胞。(4)原代培養。如果有組織塊未貼壁，可將其重新擺放至瓶底，干涸2～3 h后，使其重新貼壁，再浸沒于培養液中。該法不會影響同瓶中其他已萌出細胞的生長。(5)細胞純度。組織塊貼壁法培養的平滑肌細胞純度相對低，但是傳代至第3代時，細胞的純度即可達到95%以上，適于進行后期實驗。(6)免疫組化。α－平滑肌肌動蛋白(α－SMA)是細胞內六種肌動蛋白亞類之一，在所有真核細胞中的表達都高度保守。它們沿微管組成了細胞骨架的主要成分，編碼它的基因是相對局限于在血管平滑肌細胞中表達的少數幾個基因之一，公認是血管平滑肌細胞表型轉化的標志。

本研究建立了用人的腸系膜動脈培養血管平滑肌細胞的體外模型，所介紹的組織貼塊法培養的成人腸系膜動脈平滑肌細胞，較為成熟，簡單、經濟、易行，可為心血管疾病病因、機制的研究和防治提供一個理想的實驗材料。

［1］梁若斯，陳 德.成人動脈平滑肌細胞體外培養模型的建立［J］.中國現代醫學雜志，2002，12(10):31－34.

［2］周曉莉，雷 寒，柳 青.血管平滑肌細胞的培養及鑒定［J］. 重慶醫學，2005，34(6):877－878.

［3］呂 平，申海濤，張 浩.消化法培養大鼠腦血管平滑肌細胞［J］.中國藥理學通報，2007，23(2):137－139.

［4］周曉莉，雷 寒，柳 青.小鼠主動脈平滑肌細胞的培養［J］. 基礎醫學與臨床，2005，25(6):564－567.

［5］王生蘭，蘇 娟，徐一洲.大鼠血管平滑肌細胞體外培養的表型轉換及其鑒定［J］.中國動脈硬化雜志，2008，10(4):268 －272.

［6］司徒鎮強，吳軍正.細胞培養［M］.西安:世界圖書出版社，2004:71－77.

［7］蔡文琴.現代實用細胞與分子生物學實驗技術［M］.北京:人民軍醫出版社，2003:13－16.

［8］郭永平，張敏芳，袁江姿.人臍動脈平滑肌細胞體外培養［J］. 上海交通大學學報，2007，27(9):1008－1091.

Experimental study of human mesenteric artery smooth muscle cell cultured by tissuepiece inoculation

GUO Qianghua，SONG Weipeng，WANG Qingsheng，and LIU Li.1.Department of Cardiology;2.ICU，Qinhuangdao First Hospital，Qinhuangdao 066000，China

ObjectiveTo establish a method for culture of human mesenteric artery smooth muscle cell(hVSMC)by tissuepiece inoculation in vitro and to provide new technology to study cardiovascular diseases.Methods The tissue－piece inoculation method was applied to cell primary culture of hVSMC.Morphology of the cells was observed by inverted microscopy and identified by immunohistochemical methods.Results A great quantity of single hVSMC were obtained by tissue－piece inoculation.The cultured hVSMC showed typical“peak and valley”pattern and immunohistochemical staining showed that all the cells were positive.Conclusions The hVSMC are obtained by tissue－piece inoculation.This method provides good study material to research cardiovascular diseases.

human beings;mesenteric artery;smooth muscle cells;cell culture

R541.3

國家十一五科技支撐計劃資助課題(2006BMI01A03－2)

國強華，男，1979年出生。碩士，主治醫師。主要從事老年心血管病研究。

066000，秦皇島市第一醫院:1.心內三科;2.重癥醫學科通訊作者:劉 麗，E－mail:lucy301bj@vip.sina.com

(2012－06－08收稿 2012－07－26修回)

(責任編輯 梁秋野)

臨床經驗總結