四種植物提取液抑菌作用的分析

劉 偉，王 冰，周麗威，宋金枝，顧地周

(通化師范學院 生物系，吉林 通化 134002)

植物合成芳香簇化合物的能力幾乎是無限的，其中大部分是酚類物質和它們的衍生物[1].其中絕大多數是次生代謝產物，現在分離到的至少有12000種以上，約占自然界中總數的10%[2].其中的大多數化學物質如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾體、酚類、獨特的氨基酸和多糖等均具有殺蟲或抗菌活性[3].

長白山區地處北溫帶和寒溫帶氣候類型，植物資源非常豐富.我們選取了四種長白山區常見的植物作為研究對象，研究其對三種植物病原細菌的殺菌活性.其中白屈菜、胡桃楸、細葉杜香為長白山區野生有毒植物資源[4].白屈菜為罌粟科白屈菜屬植物，主要有效成分是生物堿類物質，包括白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿等[5].已有關于其對抑制植物病原真菌活性的研究[6]，發現其對蘑菇根霉病菌菌絲生長有顯著的抑制作用；也有研究白屈菜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌抑菌活性的報道，發現白屈菜提取液對這些病原菌有明顯的抑制作用[7].白屈菜的有效成分中，以白屈菜紅堿的研究最多，范海延等人對白屈菜紅堿進行了提取并測定了其抑菌活性，發現它對多種植物病原真菌有抑菌活性[8].同時，也有研究發現，胡桃楸[9]、細葉杜香[10]、蒲公英[11]具有一定的抑菌活性.但對植物病原細菌的抑菌活性研究相對較少，本文利用上述四種植物提取物，對三種黃單胞菌屬植物病原細菌的抑菌作用進行研究，為進一步開發利用植物源殺菌劑提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物.白屈菜(ChelidoniummaiusL.)、蒲公英(Taraxacum)，采于通化師范學院附近山區；細葉杜香(LedumpalustreL.var)、胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)采于白雞腰國家自然保護區.白屈菜取地上部分(莖葉)和地下部分(根)分開采集、處理；蒲公英取全草；細葉杜香和胡桃楸取葉.

供試菌株.甘藍黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、水稻細條病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)由廣西大學生科院提供.

培養基.NYGB培養基用于甘藍黑腐病菌的培養.OB培養基用于水稻白葉枯病菌的培養.NB培養基用于水稻細條斑病菌的培養.

1.2 試驗方法

(1)植物材料的采集及提取液的提取.將采集的植物洗凈泥土和雜質，置于室內陰涼通風處陰干，干燥后的植物用粉碎機粉碎，過篩.每種植物各稱取100g，加入2L蒸餾水浸泡12h后，文火熬三次，后兩次均加水1L熬到200ml左右，合并濾液，用多層紗布過濾，再用濾紙過濾，加熱濃縮至100ml，制成水劑.用細菌過濾器過濾兩次，得到質量濃度為0.5g/ml的植物提取液的母液，放4℃冰箱中備用.

(2)菌懸液的制備.將金甘藍黑腐病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細條病菌分別接種NYG、OB、NB液體培養基中，28℃，200rpm搖床過夜培養，選取處于對數生長期的菌體，測OD600，調整OD600=1.0，稀釋涂板，菌落計數.

(3)最低抑菌濃度的測定.取供試藥液母液，濃度為0.5g/ml，以此濃度用相應培養基進行2倍稀釋，以培養基加入相應藥液為空白對照，培養基加入菌液做陰性對照，培養基加入菌液和卡那霉素作為陽性對照.在96孔細胞培養板內加入相應量的培養基和藥液，配成濃度依次為0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的溶液，分別加入20μl菌液(菌液濃度約為108cfu/ml)，在96孔板內混合后，置于28℃恒溫培養箱內培養48h后觀察結果，空白對照和陽性對照應為沒有渾濁的澄清溶液，陰性對照為渾濁液體，沒有渾濁孔中的最低藥液質量濃度為樣品對供試細菌的最低抑菌質量濃度(MIC).所有實驗均重復三次.

(4)帶藥培養基的制備.取已制備好的植物提取物母液4ml加入到6ml已滅菌的固體培養基中，搖勻，倒入滅菌培養皿中配成終濃度為0.2g/ml的固體帶藥培養基.其他濃度依此方法分別配成終濃度為0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的固體帶藥培養基.

表1 4種植物對三種植物病原菌的最低抑菌濃度

注：+表示細菌能夠正常生長，-表示細菌不能夠正常生長。

2 結果與分析

2.1 抑菌試驗結果

采用96孔板法[12]測定了四種植物對三種植物病原細菌的抑菌作用，同時用帶藥平板法對最低抑菌質量濃度進行檢驗，結果與96孔板法基本一致.白屈菜、胡桃楸、蒲公英的提取液對三種植物病原細菌都有一定的抑菌活性，而細葉杜香的提取液對三種植物病原細菌都沒有抑菌活性.白屈菜(莖葉)和蒲公英提取液的抑菌效果相似，抑菌效果最好，胡桃楸和白屈菜(根)提取液的效果稍差.

2.2 四種植物對植物病原細菌的最低抑菌濃度

通過最低抑菌濃度測定可知(見表1)，白屈菜(莖葉)和蒲公英提取液對Xcc、Xoc、Xoo三種植物病原細菌的最低抑菌濃度均為0.1g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml，其中對Xoo的抑菌效果最好；白屈菜(根)提取液對三種植物病原細菌的最低抑菌濃度均為0.2g/ml；胡桃楸提取液對三種植物病原細菌的最低抑菌濃度分別是0.1g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml，其中對Xoc的抑菌效果要差一些.

3 結論與討論

通過四種植物提取液對三種黃單胞菌屬植物病原細菌抑菌活性的測定，發現白屈菜、胡桃楸和蒲公英對三種細菌都有不同程度的抑菌效果，而細葉杜香在本實驗中未發現有抑菌活性.不同植物提取液對三種細菌的抑菌活性相差較大，而同一植物對三種細菌的抑菌活性基本相近.雖然目前對白屈菜及其生物堿抑菌活性研究較多，但對其不同部位有效成分含量尚沒有深入研究，本研究中其地上部分提取液的抑菌效果要好于地下部分，其地上部分有效成分含量應高于地下部分.此前，胡桃楸在醫藥方面開展了一些研究，通過本文說明其對植物病原細菌也有一定的抑菌活性，對其抑菌活性成分及抑菌機理方面的研究有待開展.已有多篇文獻報道蒲公英對植物病原真菌具有顯著的抑菌作用，本研究豐富了蒲公英的抑菌譜，可為其開發提供參考依據.

不同植物所含有效成分各異，對于不同提取方法得到的有效成分含量也不同，所以利用不同提取方法提取有效成分，進行抑菌試驗的效果有所差異.為了防止高溫導致有效成分的分解，在對植物樣品烘干時避免使用高溫烘干、提取液除菌時使用細菌過濾器而未采用高壓滅菌.但實驗中細葉杜香未發現有抑菌活性，這可能與提取物的有效成分有關，在以往的研究中細葉杜香揮發油成分具有抑菌活性[10]，本文中所用提取方法會導致揮發物質損失，所以檢測不到細葉杜香的抑菌活性，也進一步證實，細葉杜香的抑菌活性成分存在于揮發油中.現在對于植物抑菌作用的報道較多，但是真正存在于這些植物體內的抑菌活性物質是什么？主要分布在植物哪些部位？還有待深入研究.

參考文獻：

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