CO2激光輻照誘變選育納豆芽孢桿菌高抗菌活性菌株

黃純純 陳建軍 張巧央 柴央央 蔣王輝 葛永達

（臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工學(xué)院，浙江 臺州 318000）

激光又名光微粒，它是一種量子流。通過激光輻射可產(chǎn)生熱、光、電磁效應(yīng)及壓力等綜合效用，它能引起細胞RNA或DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而直接或間接地影響生物有機體的生理功能，促使細胞代謝活動的改變，以致使細胞顯現(xiàn)出突變的性狀［1］。

納豆菌是作為生產(chǎn)納豆的菌種，它屬于革蘭氏陽性好氧菌［2］。通過納豆菌發(fā)酵所得的大豆人們稱之為納豆，它具有非常豐富營養(yǎng)價值，具有很好的保健功能，在溶血栓、抗菌等方面都具有非常好的功效［3］，可以說是藥食兼用。對于納豆菌代謝產(chǎn)物的抗菌活性的研究始于第二次世界大戰(zhàn)，日本對納豆菌的研究展開較早，當(dāng)前世界上很多國家也都加入到納豆菌的研究工作中。現(xiàn)階段國內(nèi)的研究重點主要集中在納豆激酶各方面，關(guān)于納豆菌抗菌作用的研究報道較少［4］。本研究采用紅外CO2激光輻照納豆芽孢桿菌篩選得到高抗菌活性突變株，其抗菌活性提高顯著，從而為納豆菌在抗菌領(lǐng)域，甚至可以說是天然生物防腐劑的開發(fā)研究方面提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

用于生產(chǎn)出發(fā)菌株是納豆芽孢桿菌Bacillus subtilis nattoS252；用于生物效價分析測試的指示菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。

1.2 培養(yǎng)基

蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、瓊脂18g、氯化鈉5g，用蒸餾水定容至1L，pH 7.2±0.1。實驗時可用于生產(chǎn)菌株的斜面種子培養(yǎng)；同時可用于指示菌斜面及平皿培養(yǎng)。（液體蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基不加瓊脂，其他組份相同）。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖4g，氯化鈉為4g，酵母膏4g，胰蛋白胨8g，牛肉膏4g，用蒸餾水定容至1L，pH值7.0±0.1。實驗時可用于生產(chǎn)菌株種子培養(yǎng)。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g，玉米漿3g，葡萄糖5g，甘油10g，可溶性淀粉8g，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鉀4g，氯化鈉3g，用蒸餾水定容至1L，pH值7.0±0.1。實驗時可用于生產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 菌種活化

挑1環(huán)Bacillus subtilis nattoS252菌種，接至新鮮斜面培養(yǎng)基內(nèi)，置28℃培養(yǎng)24h后，配制成每毫升含1.5×103個細胞的懸液，移取2mL至安培管內(nèi)供照射使用。

1.4 CO2激光照射

取激光束光斑直徑為0.4cm設(shè)定照射距離為23cm，照射時間依次設(shè)定為5s，10s，15s，20s，25s，30s，35s，40s，對照組照射時間設(shè)定為0s，平行3組，確定最佳輻照劑量。

1.5 輻照菌株培養(yǎng)

用生理鹽水將最佳條件的照射菌株懸液稀釋成原濃度的10-1～10-6倍，然后移取0.2mL涂布平皿，每種稀釋度用3個平皿。置于28℃下培養(yǎng)24h后，挑出形態(tài)大小不同的單菌落，在與平皿等同條件下進行斜面培養(yǎng)。從斜面上挑幾環(huán)菌體接入到液體種子培養(yǎng)基，置于28℃下培養(yǎng)18h后，移取2mL種子液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于32℃下培養(yǎng)36h得發(fā)酵液。液體種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)時裝液量均為20mL/100mL搖瓶，搖床轉(zhuǎn)速180r/min。

1.6 指示菌懸液制備

挑取幾環(huán)活化后的斜面指示菌分別接入至各液體培養(yǎng)基中，置于37℃下培養(yǎng)24h即得菌懸液，采取10倍稀釋法稀釋，測出菌濃，而后用無菌水將之稀釋成105～106個/mL用作平皿涂布。

1.7 抗菌活性的檢測方法-管碟法［5］

將上述所得的發(fā)酵液在8000r/min，30min下離心分離即得上清液，作為抗菌粗提液。將濃度為105～106/mL的指示菌懸液涂在裝有固體培養(yǎng)基的平皿上，放上牛津杯，吸取200μL抗菌粗提液至牛津杯。置于37℃培養(yǎng)24h后，測量出透明抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體致死與CO2激光照射時間之間的關(guān)系

在一定照射距離下，采用CO2激光照射、菌體致死率與照射時間的關(guān)系見圖1。微生物在誘變過程中，當(dāng)致死率在75％～80％范圍時，正向突變率被普遍認為是較高的［6］。據(jù)此本實驗采用30s作為該菌株的CO2激光照射時間。

2.2 CO2激光照射納豆芽孢桿菌誘變篩選結(jié)果

本實驗應(yīng)用紅外CO2激光輻照納豆芽孢桿菌Bacillus subtilis natto S252，輻照效果明顯，獲得5株抗菌活性較高的突變株，結(jié)果見表1，表1中的數(shù)值是3次平行實驗均值，其中突變株F604抗菌活性最高，它的抗菌活性對指示菌金黃色葡萄球菌及大腸桿菌較出發(fā)菌株分別提高1.26倍和1.43倍。有可能是對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑制是由不同抗菌物質(zhì)所造成。

表1 高抗菌活性異變株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of mutant on high antibacterial activity

2.3 突變株F604抗菌活性的穩(wěn)定性實驗

將通過紅外CO2激光輻照得到的高抗菌活性突變株F604作繼代抗菌活性穩(wěn)定性實驗，每隔2代測一數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2，表2中的數(shù)值是3次平行實驗均值，表明此突變株F604的抗菌活性在傳代過程中較為穩(wěn)定，更加說明了在微生物誘變上采用紅外CO2激光輻照技術(shù)是可行的。

表2 突變株F604傳代過程中抗菌活性穩(wěn)定性試驗Table 2 Stability test of mutant F604 on antibacterial activity during subculture

3 結(jié)論

紅外CO2激光輻照能引起細胞RNA或DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而直接或間接地影響生物有機體的生理功能，促使細胞代謝活動的改變，以致使細胞顯現(xiàn)出突變的性狀。本次實驗使用紅外CO2激光輻照納豆芽孢桿菌Bacillus natto S252，篩選得到1株抗菌活性較高的突變株F604，它的抗菌活性對指示菌金黃色葡萄球菌及大腸桿菌較出發(fā)菌株分別提高1.26和1.43倍，說明在微生物誘變育種過程中應(yīng)用CO2激光輻照射技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。

［1］胡衛(wèi)紅，陳有為，李紹蘭，等.激光輻照微生物的研究概況［J］.激光生物學(xué)報，1999，8（1）：66-69.

［2］鮑艷玲，倪孟祥，錢之玉，等.納豆激酶搖床發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12（1）：19-21.

［3］梁淑娃，夏楓耿，彭中健，等.納豆激酶液體深層發(fā)酵技術(shù)的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（6）：1-3.

［4］鐘青萍，余世望，梁勝媛.納豆菌的抗菌作用及其培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2001，22（5）：20-22.

［5］岑沛霖，蔡謹.工業(yè)微生物學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：10-100.

［6］沈同，王鏡巖.生物化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，1991：176-177.