電氣石/水凝膠復(fù)合材料體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

李小玉,趙 凱,肖建剛,李峻峰

(1.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610041; 2.四川大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610065; 3.成都理工大學(xué)材料科學(xué)技術(shù)研究所,四川成都 610059)

0 引 言

電氣石是以含硼為主的環(huán)狀硅酸鹽礦物,其化學(xué)式為,Na(Mg,Fe,Mn,Li,Al)3Al6[Si6O18](BO3)3(OH,F)4,屬三方晶系.通常,天然電氣石的復(fù)雜化學(xué)成分和晶體結(jié)構(gòu)使電氣石具有自發(fā)極化、紅外輻射、釋放負(fù)離子等特性[1].有研究發(fā)現(xiàn),電氣石微粉對(duì)水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)的改善有明顯作用,能夠使水分子團(tuán)簇中的氫鍵穩(wěn)定性下降,并影響離子的轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)電離,降低締合度,使水形成小分子團(tuán)[2].一般認(rèn)為,水分子團(tuán)愈小,水的活性愈高,可使水分子透入細(xì)胞膜的數(shù)量和速度大為增加,利于細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖.近期的相關(guān)研究表明,電氣石能消除過(guò)剩自由基,活化組織細(xì)胞,并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖顯著地促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生物量的增加[3-4].

目前,科研人員對(duì)于電氣石的基本性質(zhì)與相關(guān)理論研究已日趨深入,但對(duì)其在生物醫(yī)用領(lǐng)域,尤其是在人體組織修復(fù)方面的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究將電氣石復(fù)合到水凝膠中,分析電氣石對(duì)人成骨肉瘤MG63細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,為電氣石在組織修復(fù)新材料方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料制備與表征

在燒杯中加入一定質(zhì)量的水凝膠、電氣石粉體和輔料,再加入蒸餾水,并用電動(dòng)攪拌器混合均勻,室溫下注入凝固液制成電氣石/水凝膠復(fù)合材料.電氣石與水凝膠的質(zhì)量比分別為,1∶20、1∶10、1∶5、1∶2.復(fù)合材料用去離子水沖洗后備用.

在倒置顯微鏡(TE2000-U,Nikon)下觀察復(fù)合材料的形態(tài)并照相.磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)沖洗復(fù)合材料3次,戊二醛固定 3h, 30%、50%、75%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水,15 min/次,乙酸異戊酯替換30 min,臨界點(diǎn)干燥后用掃描電子顯微鏡(JSM-5600LV,JEOL)觀察復(fù)合材料形貌并照相.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用人成骨肉瘤MG63細(xì)胞由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院提供.

將冷凍細(xì)胞置于37℃恒溫水浴中快速融化, 1 000 rpm離心8 min(LD4-2型離心機(jī),江陰市科研器械廠),加入含10%小牛血清(G ibco Inc.)的F12培養(yǎng)基(Invitrogen Inc.)培養(yǎng)(100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素),次日換液.待細(xì)胞貼滿瓶壁后,用胰酶(Sigma Inc.)消化,吹打制成細(xì)胞懸液,分瓶后繼續(xù)培養(yǎng).

將電氣石/水凝膠復(fù)合材料(1 cm×2 mm)用蒸餾水超聲清洗3次,干燥后,置于24孔板(Corning Inc.)中,紫外滅菌,加入含10%小牛血清的F12培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜.

吸棄原有培養(yǎng)基,取人成骨肉瘤MG63細(xì)胞,用胰酶消化,吹打制成細(xì)胞懸液,按照2×104個(gè)/mL的密度接種細(xì)胞,每孔接種1 mL,使細(xì)胞自然沉降在材料表面,隔天更換新鮮培養(yǎng)基.另外,不放置材料的孔作為空白對(duì)照.

1.3 細(xì)胞相容性檢測(cè)

在培養(yǎng)第4 d,用倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)的人成骨肉瘤MG63細(xì)胞的形態(tài)并照相.吸棄原有培養(yǎng)基, PBS吹洗3次.避光條件下,按照Live&Dead Cells試劑盒(Molecular Probes Inc.)說(shuō)明配制熒光染色工作液,每孔加入熒光染色工作液100μL,放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,PBS吹洗,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照.電氣石與細(xì)胞共培養(yǎng)4 d、10 d、15 d時(shí)各取一板細(xì)胞,吸棄原有培養(yǎng)基,加入1 mL新鮮F12培養(yǎng)基,每孔加入40μL 5 mg/mL的MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,Sigma Inc.),放于培養(yǎng)箱中孵育3.5 h后,吸棄液體,加入450μL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),振搖 5 min,放于培養(yǎng)箱孵育 30 min,振搖5 min,取150μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到96孔板中,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(PerkinElmer wallac 1420)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其光吸收值.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料形貌

對(duì)實(shí)驗(yàn)制備的3號(hào)樣品用光鏡及電子掃描顯微鏡觀察其形貌,結(jié)果如圖1所示.

圖1 3號(hào)復(fù)合樣品光鏡與電子掃描顯微鏡照片形貌

圖1(a)為電氣石粉末復(fù)合到水凝膠中的光鏡照片,由圖可見(jiàn)電氣石呈大小不一的片狀,不均勻地分散在水凝膠中.圖1(b)為電子掃描顯微鏡照片,從材料的表面可看到電氣石的塊狀突起,粒徑在100μm以下,密度較大,說(shuō)明其分散狀況良好.

2.2 細(xì)胞形態(tài)

人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d后的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示.

圖2 MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d的細(xì)胞形態(tài)

由圖2可見(jiàn),培養(yǎng)4 d后,培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞形態(tài)多為梭形或多邊形貼壁生長(zhǎng),胞質(zhì)、胞仁明顯,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞無(wú)衰老及異常分裂現(xiàn)象.其中:1號(hào)培養(yǎng)板上(圖2(b))細(xì)胞分散狀況好,生長(zhǎng)良好;2號(hào)培養(yǎng)板上(圖2(c))細(xì)胞團(tuán)聚生長(zhǎng),有少量懸浮死亡的細(xì)胞;3號(hào)培養(yǎng)板上圖(2(d))細(xì)胞團(tuán)聚,生長(zhǎng)良好;4號(hào)培養(yǎng)板上(圖2(e))細(xì)胞生長(zhǎng)較分散,成單層生長(zhǎng),伸出較多偽足.細(xì)胞形態(tài)分析顯示,人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與不同比例的復(fù)合材料共培養(yǎng)均能夠正常生長(zhǎng),不影響細(xì)胞形態(tài)及增殖,此表明復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性及表面活性,對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用.

2.3 細(xì)胞活性

Calcein-AM和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)溶液可分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色.Calcein-AM可透過(guò)細(xì)胞膜,通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用,脫去AM基,產(chǎn)生的鈣黃綠素(Calcein)能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光,其僅對(duì)活細(xì)胞染色.而作為核染色染料的PI不能穿過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜,卻能夠嵌入死細(xì)胞的DNA雙螺旋而產(chǎn)生紅色熒光,其僅對(duì)死細(xì)胞染色.由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm波光熒光激發(fā),因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞.人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d的熒光染色照片如圖3所示.

圖3 MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d熒光染色照片

從圖3可以看出,人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d后,細(xì)胞成片生長(zhǎng),呈單層鋪展,形態(tài)正常,為三角形或多邊形,生長(zhǎng)及增殖狀況良好,死亡細(xì)胞少.其中:1號(hào)培養(yǎng)板上(圖3(b))細(xì)胞大小不一,密集處細(xì)胞體積小;2號(hào)培養(yǎng)板上(圖3(c))細(xì)胞體積差別小;3號(hào)培養(yǎng)板上(圖3(d))細(xì)胞較其他組稀疏,偽足長(zhǎng),死亡細(xì)胞較集中;4號(hào)培養(yǎng)板上(圖3(e))細(xì)胞較密集,細(xì)胞體積差別大.熒光形態(tài)分析顯示,人成骨肉瘤MG63細(xì)胞能夠伸出偽足與復(fù)合材料良好地粘附,形態(tài)良好,密度大,死亡少,表明復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性及表面活性,對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用,細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)及增殖.

2.4 細(xì)胞增殖

MTT比色法[5]是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖性的有效的方法,其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫結(jié)晶物,并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能.人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d后,粘附在培養(yǎng)板上的細(xì)胞增殖情況如圖4所示.

從圖4可見(jiàn),人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)4 d后,實(shí)驗(yàn)組的數(shù)值高于對(duì)照組,各組間無(wú)顯著性差異(p>0.05);到第10 d,吸收值達(dá)到高峰,對(duì)照組增殖迅速(p<0.01),明顯高于實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著性差異(p>0.05);到第15 d,各組吸光值均下降,各組不存在顯著性差異(p> 0.05).后期對(duì)照組明顯比實(shí)驗(yàn)組增殖快,這是由于實(shí)驗(yàn)組可供粘附的板面積比空白組小,并且部分細(xì)胞粘附到了材料上,使生長(zhǎng)在板上的細(xì)胞數(shù)量減少,從而導(dǎo)致后期對(duì)照組的比色值高于各實(shí)驗(yàn)組.隨后,由于細(xì)胞間接觸抑制使得少量細(xì)胞脫落,各組值下降.實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)合材料對(duì)于細(xì)胞有一定的親和力,細(xì)胞能夠粘附生長(zhǎng),無(wú)明顯毒副作用.

圖4 MG63細(xì)胞與不同比例復(fù)合材料共培養(yǎng)在板上的增殖情況

3 結(jié) 論

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),人成骨肉瘤MG63細(xì)胞與電氣石/水凝膠復(fù)合材料共培養(yǎng)不影響細(xì)胞正常的生長(zhǎng)及增殖,細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯,大小及密度適中,無(wú)異常分裂現(xiàn)象,死亡細(xì)胞少,表明電氣石/水凝膠復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞形容性,無(wú)明顯毒副作用,可以用作組織構(gòu)建.本研究證實(shí),電氣石與水凝膠復(fù)合后不僅保留了電氣石的優(yōu)良特性,也具有良好的生物相容性,此為其在生物材料方面的應(yīng)用提供了一種新思路.

[1]王光華,董發(fā)勤.電氣石的功能屬性及應(yīng)用[J].中國(guó)非金屬礦工業(yè)導(dǎo)刊,2007,28(5):9-11.

[2]夏枚生,胡彩虹,張紅梅,等.電氣石處理水對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)和堿性磷酸酶活性的影響[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2005,27(3):358-362.

[3]駱靖中.電氣石的特性及其在健康與環(huán)保領(lǐng)域的新用途[J].中國(guó)非金屬礦工業(yè)導(dǎo)刊,2007,28(6):17-19.

[4]黃城貴,潘麗萍,李海航,等.電氣石對(duì)綠豆培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].生物技術(shù),2008,18(3):61-63.

[5]趙嘉惠,張華屏,王春芳.MTT法在檢測(cè)細(xì)胞增殖方面的探討[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(3):262-263.