益生菌混合菌種在發(fā)酵豆乳中的優(yōu)化

高鳳祥， 張艷杰

（1.北華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林省 吉林市 132013；2.北華大學(xué) 后勤管理處，吉林省 吉林市 132013；3.北華大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林省 吉林市 132013）

益生菌混合菌種在發(fā)酵豆乳中的優(yōu)化

高鳳祥1，2， 張艷杰3

（1.北華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林省 吉林市 132013；2.北華大學(xué) 后勤管理處，吉林省 吉林市 132013；3.北華大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林省 吉林市 132013）

采用益生菌混合物AST和TLB分別在42℃進(jìn)行豆乳的發(fā)酵，在發(fā)酵豆乳的發(fā)酵和貯存過程中（4℃下28 d），觀察p H值和活菌數(shù)的變化情況。在AST益生菌混合物（嗜酸性乳桿菌，雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌）的培育下，42℃下發(fā)酵時間減少到8 h。但嗜酸性乳桿菌在冷藏的過程中生存狀態(tài)較差，其活菌數(shù)在冷藏后一周后未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。將豆乳在42℃下用TLB益生菌（嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌和動物雙歧桿菌乳酸亞種Bb12）進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)酵時間縮短到4 h，雙歧桿菌活菌數(shù)目的對數(shù)增加了約一半，而且經(jīng)過28 d的冷藏，細(xì)菌數(shù)仍然維持在107CFU／m L以上。

發(fā)酵豆乳；益生菌；乳桿菌；雙歧桿菌；存活性

基于營養(yǎng)和健康的因素，豆乳制品越來越受到歡迎。我國是大豆的故鄉(xiāng)，大豆中含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、多種維生素、礦物質(zhì)和其它各種營養(yǎng)素。在中國，牛乳制品占主導(dǎo)地位，這對消費者而言，可供選擇的種類單一，尤其對牛乳過敏的消費者和素食主義者更是望而卻步。豆乳含有豐富的低聚糖，是促乳酸菌特別是雙歧桿菌生長的良好益生元［1］，而發(fā)酵豆乳既能發(fā)揮大豆的營養(yǎng)功效又能去除大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，這是一種集大豆?fàn)I養(yǎng)與乳酸菌功效于一體的新型保健產(chǎn)品［2］。

目前，最常見的益生菌基本都屬于乳酸菌和雙歧桿菌菌屬［3］。采用單一益生菌進(jìn)行豆乳發(fā)酵，如鼠李糖乳桿菌（Lactobaci lus acidophillus GG）或動物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp.lactisBb12），發(fā)酵時間一般要18 h以上［4］。因此，為了縮短發(fā)酵時間，Bozanic等人［5］采用了BCT混合益生菌培養(yǎng)物（含有雙歧桿菌Bifidobacterium spp.，干酪乳桿菌Lactobacillus casei和嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus）進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間縮短為6～7 h，但是其發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)并未明顯增加。

本研究的目的是在合適的時間內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵并在最后的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生足夠的活益生菌（單種益生菌數(shù)＞106 CFU／m L），并且能夠穩(wěn)定冷藏超過28 d，這也是我國益生菌產(chǎn)品的基本要求［6］。作者采用了兩種不同的益生菌混合培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵，首先采用3種益生菌混合菌種（AST組合）嗜酸性乳桿菌，雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌，隨后用又采用了嗜熱鏈球菌、動物雙歧桿菌乳酸亞種Bb12和保加利亞乳桿菌（TLB組合）來進(jìn)行發(fā)酵，就是為了在縮短發(fā)酵時間的基礎(chǔ)上來獲得足夠多的活益生菌。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸性乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，簡稱L.acidophilus），雙歧桿菌（Bifidobacterium spp.，簡稱B.spp）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，簡稱S.thermophilus）、動物雙歧桿菌乳酸亞種Bifidobacterium animalis subsp.lactisBb12，簡稱B.animalisBb12）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，以下簡稱L.bulgari－cus）：均由科·漢森（中國）有限公司提供。脫脂脫腥大豆粉：購自山東萬得福實業(yè)集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 器材

PHSJ－4A型p H計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫恒濕箱 ws／08－01：同濟(jì)大學(xué)機電廠；LD5－2A離心機：北京醫(yī)用離心機廠；Cary 300紫外分光光度儀：美國 Varian公司；NSC－ⅡA－1200型無菌工作臺：日本。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化將菌株接種于10 g／d L無菌脫脂乳培養(yǎng)基中，分別按最適溫度培養(yǎng)，產(chǎn)酸凝乳后即進(jìn)行傳代。經(jīng)過2～3次活化，菌種活力充分恢復(fù)后用于后續(xù)試驗。

1.3.2 發(fā)酵豆乳的制作復(fù)原豆乳（脫脂脫腥大豆粉為6 g／d L，葡萄糖為1.5 g／d L）預(yù)熱至65℃，20 MPa均質(zhì)，95℃殺菌5 min，冷卻至42℃進(jìn)行培養(yǎng)。接入發(fā)酵劑時先接入發(fā)酵劑AST（3種益生菌接種量都為1×106CFU／g豆乳），觀察記錄過程中的變化；接入發(fā)酵劑TLB（3種益生菌接種量都為1×106CFU／g豆乳）時，恒溫發(fā)酵培養(yǎng)至p H 4.6時，終止發(fā)酵［7］，冷藏于4℃。發(fā)酵期間每2小時、冷藏期間每7天取樣，用于樣品p H值游離氨基氮（FAN）以及活菌數(shù)的檢測。

1.3.3 pH值的測定精密p H計測量。

1.3.4 游離氨基氮質(zhì)量濃度的測定游離氨基氮（FAN）的測定采用鄰苯二甲醛衍生比色法，參照Lemieux等［8］和 Church等［9］的方法，在340 nm 下用分光光度計測定吸光值，確定游離氨基氮質(zhì)量濃度。

1.3.5 活菌數(shù)的測定樣品用1 g／d L滅菌蛋白胨水梯度稀釋至一定濃度后，采用培養(yǎng)基平板傾注法，測定發(fā)酵豆乳樣品中各種益生菌的活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆乳在AST混合益生菌中發(fā)酵過程及貯存過程中的變化

2.1.1 AST混合益生菌發(fā)酵過程中的化學(xué)和微生物變化采用AST混合益生菌的在42℃條件下，p H達(dá)到4.6時發(fā)酵時間只需8 h，較單菌發(fā)酵時間大大的減少。p H變化和FAN變化見圖1（a），p H值在第4小時開始下降明顯，此變化與FAN的變化趨勢相同。

圖1 豆乳在AST混合益生菌中發(fā)酵期間的p H、FAN（a）及活菌數(shù)（b）變化Fig.1 Time－course of pH，F(xiàn)AN value（a）and viable cells count（lg CFU／mL）（b）3 probiotic bacteria during soymilk fermentation with AST culture

在發(fā)酵結(jié)束后，對各時間點所取樣品進(jìn)行活菌數(shù)檢測。發(fā)酵豆乳中各種益生菌的活菌數(shù)的變化如圖1（b）所示，以嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）增加的比較明顯（1.13×108CFU／m L），但嗜酸性乳桿菌（L.acidophilus）和雙歧桿菌（B.spp）的活菌數(shù) 相 對 較 少 （1.11 × 107CFU／m L），尤 其L.acidophilus的活菌數(shù)僅為5.42×106CFU／m L，僅比接入的原始活菌數(shù)1.0×106CFU／m L高一點。

2.1.2 AST混合益生菌發(fā)酵后貯藏過程中的化學(xué)和微生物變化AST混合益生菌的發(fā)酵樣品在4℃貯藏28 d后，p H變化和FAN變化見圖2。p H值在28 d內(nèi)基本保持不變，游離氨基氮在前7天出現(xiàn)了較明顯的下降，7～28 d的FAN有所回升。

為檢測益生菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，對貯藏期發(fā)酵豆乳的活菌數(shù)需進(jìn)行檢測。發(fā)酵豆乳中各種益生菌的活菌數(shù)的變化見表1。S.thermophilus和B.spp的活菌數(shù)相對比較穩(wěn)定，但L.acidophilus在14 d后的活菌數(shù)已經(jīng)降到1.0×106CFU／m L的水平線下。

圖2 AST發(fā)酵豆乳在貯藏期間的p H和FAN變化Fig.2 Time－course of pH and FAN during 28 days of cold storage of fermented soymilk with AST culture

表1 AST 3種益生菌在發(fā)酵豆乳的貯藏過程中活菌數(shù)測定結(jié)果Tab.1 Viable cells count（lg CFU／mL）of 3 probiotic bacteria during 28 days of cold storage of soymilk fermented with AST culture （n＝3，±SD）

表1 AST 3種益生菌在發(fā)酵豆乳的貯藏過程中活菌數(shù)測定結(jié)果Tab.1 Viable cells count（lg CFU／mL）of 3 probiotic bacteria during 28 days of cold storage of soymilk fermented with AST culture （n＝3，±SD）

發(fā)酵菌株貯藏過程中的活菌數(shù)／lg（CFU／m L）1 d 7 d 14 d 21 d 28 dS.thermophilus 8.07±0.03 8.13±0.078.24±0.01L.acidophilus 6.62±0.028.17±0.13 8.09±0.116.12±0.12B.spp .7.03±0.095.75±0.065.32±0.31 4.94±0.026.83±0.217.12±0.197.08±0.03 6.91±0.05

2.2 豆乳在TLB混合益生菌中發(fā)酵過程及貯存過程中的變化

基于AST混合益生菌的發(fā)酵結(jié)果，可看出雖然發(fā)酵時間可明顯縮短，但L.acidophilus在豆乳中發(fā)酵的生存狀態(tài)較差，所以，又研究了新的益生菌搭配，采用了酸乳酪培養(yǎng)物TLB（含有保加利亞乳桿菌）進(jìn)行發(fā)酵研究。

2.2.1 TLB混合益生菌發(fā)酵過程中的化學(xué)和微生物變化采用TLB混合益生菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間只需4 h，較AST混合物發(fā)酵時間又進(jìn)一步的減少了。其過程中的p H變化和FAN變化見圖3（a），p H值在第2小時就開始有明顯的下降。

TLB混合物發(fā)酵的豆乳中各種益生菌的活菌數(shù)的變化見圖3（b）所示。依然以嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）增加的明顯（7.76×108CFU／m L），乳桿菌的生長也和AST培養(yǎng)物中類似，是生長最慢的一種益生菌，但在4 h后，保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和 動 物 雙 歧 桿 菌 乳 酸 亞 種（B.animalisBb12）的活菌數(shù)也分別達(dá)到或者接近了107CFU／m L。

圖3 豆乳在TLB混合益生菌中發(fā)酵期間的p H、FAN（a）及活菌數(shù)（b）變化Fig.3 Time－course of pH，F(xiàn)AN value （a）and viable cells count（lg（CFU／mL））（b）3 probiotic bacteria during soymilk fermentation with TLB culture

2.2.2 TLB混合益生菌發(fā)酵后貯藏過程中的化學(xué)和微生物變化TLB混合益生菌發(fā)酵后的樣品貯藏28 d后，p H變化和FAN變化見圖4。p H值在這28 d內(nèi)保持不變，游離氨基氮在前7天下降的較在AST培養(yǎng)物中緩和，整個過程基本能保持平穩(wěn)。

TLB混合物種的3種益生菌在發(fā)酵豆乳貯藏28 d后活菌數(shù)的變化見表2。S.thermophilus的活菌數(shù)貯藏28 d后出現(xiàn)了小幅度的增加，突破了109CFU／m L，L.bulgaricus略微下降，約5.45×106CFU／m L，B.animalisBb12在此期間維持的相對平穩(wěn)，約5.5×107CFU／m L。可見，此環(huán)境下的益生菌生長狀態(tài)還明顯好于AST培養(yǎng)混合物，而且發(fā)酵時間更短。

圖4 TLB發(fā)酵豆乳在貯藏期間的p H和FAN變化Fig.4 pH and FAN value of during 28 days of cold storage of soymilk fermented with TLB culture

3 結(jié)語

隨著發(fā)酵豆乳的需求日益增大，人們積極研究在豆乳發(fā)酵中所用的益生菌搭配，以求獲得最優(yōu)的豆乳飲品［10］。在豆乳發(fā)酵中有著2個關(guān)鍵的因素分別是發(fā)酵時間和發(fā)酵后及貯藏中的活菌數(shù)的含量。

作者分別通過2種不同的益生菌搭配組成相應(yīng)的培養(yǎng)物，分別是AST混合菌及TLB混合菌，在42℃的條件下發(fā)酵時間分別是8 h和4 h。Bozanic等［11］通過研究發(fā)現(xiàn)，豆乳在42℃下比37℃下發(fā)酵時間能短1～2 h，而且，雙歧桿菌以及酸奶酪益生菌（如保加利亞乳桿菌）在42℃下更適合生長。B.animalisBb12是一種能顯著利用蔗糖的益生菌，也可能是產(chǎn)生相對多的乳酸而造成TLB益生菌混合物發(fā)酵豆乳中的p H值下降更快的一個原因。.

表2 TLB 3種益生菌在發(fā)酵豆乳的貯藏過程中活菌數(shù)測定結(jié)果Tab.2 Viable cells count（lg（（CFU／mL））of 3 probiotic bacteria during 28 days of cold storage of soymilk fermented with TLB culture （n＝3，±SD）

表2 TLB 3種益生菌在發(fā)酵豆乳的貯藏過程中活菌數(shù)測定結(jié)果Tab.2 Viable cells count（lg（（CFU／mL））of 3 probiotic bacteria during 28 days of cold storage of soymilk fermented with TLB culture （n＝3，±SD）

發(fā)酵菌株貯藏過程中的活菌數(shù)／lg（CFU／m L）1 d 7 d 14 d 21 d 28 dS.thermophilus 8.75±0.01 8.93±0.178.74±0.02L.bulgaricus 6.92±0.098.89±0.15 9.11±0.176.82±0.05Bb127.53±0.026.75±0.166.86±0.21 6.74±0.097.48±0.117.32±0.237.41±0.13 7.75±0.15

TLB益生菌混合物能將發(fā)酵時間縮短為4 h，極大的提高了生產(chǎn)酸豆奶的生產(chǎn)效率，并提高了設(shè)備利用率，而且還保證了發(fā)酵豆乳中益生菌的數(shù)量能維持在107CFU／m L以上，下一步實驗將研究各益生菌中的配比問題，爭取獲得一個最佳比例的搭配。本研究為工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵大豆酸乳產(chǎn)品及其推廣應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，同時為研制和開發(fā)其它多功能益生菌豆乳制品提供了新的思路和方法。

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Optimizing Fermentation of Soymilk with Combination of Probiotic Bacteria

GAO Feng－xiang1，2，ZHANG Yan－jie3
（1.College of Public Health，Beihua University，Jilin 132013，China；2.Logistics Management Office，Beihua University，Jilin 132013，China；3.Affiliated Hospital，Beihua University，Jilin 132013，China）

The objective of this study is to produce a probiotic fermented soymilk with the aim of shortening the fermentation time.For this，soymilk was fermented with probiotic culture AST and yoghurt culture TLB at 42℃，during the fermentation and storage of the fermented soymilk（28 days at 4℃，the changes in pH－value and viable cells count were observed.Fermentation time significantly reduces to 8 h at 42℃ with AST culture（Lactobacillus acidophilus，Bifidobacterium spp.，and Streptococcus thermophilus）.However，Lactobacillus acidophilus survived poorly during cold storage and the viable cells count was under the probiotic minimum as soon as after the first week of storage.Soymilk was fermented at 42℃ with TLB culture（Streptococcus thermophilus，Lactobacillus bulgaricus，Bifidobacterium animalis subsp.lactis Bb12）.Consequently，the fermentation time was shortened to 4 hours whereby the viable cells count of bifidobacteria increased during fermentation for the half of the logarithm scale approximately.During 28 days of cold storage，bacterial count remained over 107 cfu／m L.

fermentation of soymilk，probiotic strain，Lactobacillus，Bifidobacterium，survival

高鳳祥（1971－），男，吉林省吉林市人，工程師，主要從事食品工程方面的研究。E－mail：583419733＠qq.com

TQ 920.1

A

1673－1689（2012）04－0443－05

2011－03－08