啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的測定

彭曉斌， 李新良

（上海尤特爾生化有限公司，上海 浦東 201201）

啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的測定

彭曉斌， 李新良

（上海尤特爾生化有限公司，上海 浦東 201201）

采用高效液相色譜法對啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進行分析檢測。選用色譜柱Zorbax Eclipose XDB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇－0.05%磷酸水溶液（體積比20∶80），柱溫30℃，流速1.0 m L／min，檢測波長210 nm。在此條件下，DON得到很好分離，在0.75～100 mg／L范圍內線性關系良好，R2＝0.999 3，外加標回收率在85.36%～96.92%之間，RSD為4.21%，該方法可以簡便、準確地測定啤酒中DON含量。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；啤酒；高效液相色譜

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，縮寫為DON）于1970年由日本諸罔信一首先分離提純，化學名稱為3α，7α，15－三羥基草鐮孢菌－9－烯－8－酮.屬單端孢霉烯族化合物，因一定劑量DON能使動物嘔吐故又名嘔吐毒素（后文脫氧雪腐鐮刀菌烯醇均以嘔吐毒素簡稱），結構式見圖1。純品為白色長方形結晶，相對分子質量296.3，熔點為151～153℃，主要是由于感染鐮刀菌的小麥、大麥、玉米等谷物，在田間生長過程或制麥過程中產生，從而將毒素帶入啤酒。國外學者研究發現在釀造過程中，麥汁煮沸時嘔吐毒素含量增加了3倍［2］，嘔吐毒素從原料到成品大約有60%～80%殘留［3］。目前國內外采用酶聯免疫法、高效液相色譜或氣相色譜法對釀造原料及產品中嘔吐毒素進行檢測［4－9］，由于酶本身不穩定，可能產生假陽、陰性結果，重復性差，檢測精度有待于提高，氣相色譜檢測則需要對樣品進行衍生化處理。所以液相或液相質譜是近年來使用最為廣泛的方法。作者建立一種高效液相色譜－紫外檢測法測定啤酒中嘔吐毒素含量的方法。

圖1 嘔吐毒素化學結構圖Fig.1 Chemical structure of deoxynivalenol

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒樣品：市售與公司送樣；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標樣：購自Sigma公司，純度≥99%；甲醇：色譜純；水：Mili Q；三氯甲烷、石油醚、磷酸：均為國產分析純。

Waters 600高效液相色譜儀，Waters 600泵，Waters Platform ZMD 4600，Breeze色譜工作站，真空旋轉蒸發儀。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX Eclipose XDB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流 動 相 為 甲 醇 －0.05%（體積分數）磷酸水溶液（體積比20︰80）等濃度洗脫，檢測波長210 nm［5］，柱溫30℃，進樣量10μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 標樣配制準確稱取嘔吐毒素固體標準樣品1 mg，（精確到0.01 mg），轉移到10 m L容量瓶，在20℃下用色譜純甲醇定容到刻度，作為儲備液儲存于2～4℃的冰箱。

1.3.2 樣品預處理取100 m L除氣啤酒，加入6 g NaCl混合均勻后，倒入250 m L分液漏斗，取100 m L氯仿，分3次萃取（40，30，30 m L），靜置分層，取下層液體，最后合并萃取劑，于45℃下旋轉蒸發至干，再分別用50 m L石油醚與30 m L體積分數80%甲醇水溶液溶解萃取物倒入250 m L分液漏斗，搖勻靜置分層后，取下層液體，再于55℃旋轉蒸發至干，1 m L流動相洗脫并定容，用0.22μm無機濾膜過濾，冷凍保存備用。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相條件對分離的影響分別考慮了用甲醇和乙腈作為流動相，發現分離效果差不多，但是甲醇的毒性與價格都相對較低。然后比較了甲醇－水（含體積分數0.05%磷酸）體系含甲醇體積分數100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%，發現在20%時雜質與嘔吐毒素能有效分離，分離度較好。作者選擇甲醇－0.05%（體積分數）磷酸水溶液（體積比20︰80）作流動相。

2.1.2 流速對分離的影響在上述色譜條件下，考察了流速分別為0.5、0.8、1.0 m L／min對分離度的影響。結果表明，采用1.0 m L／min的流速時啤酒中的嘔吐毒素分離度最好，柱效較高，樣品的雜質峰與目的峰能夠明顯分開，結果見圖2～4。

圖2 嘔吐毒素標樣HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatgram of the deoxynivalenol standard

圖3 市售啤酒HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of the market beer

圖4 由鐮刀菌污染麥芽制成啤酒HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of the beer produced from Fusarium infected malt

2.1.3 加鹽量對萃取效果的影響選取質量濃度0、3、6，9 g／d L四個梯度的加鹽量進行實驗，每個做3次重復，考察其對嘔吐毒素萃取效果的影響。結果見圖5。啤酒中水分含量很高，加鹽可以改變嘔吐毒素在水相和有機相中比例，使毒素盡可能進入有機相，有利于萃取。通過比較發現，加鹽的質量濃度超過6 g／d L之后，峰面積基本保持不變，故選擇質量濃度6 g／d L的加鹽量。

2.2 方法有效性研究

2.2.1 線性關系與檢出限將嘔吐毒素標樣分別配成150、100、75、30、15、7.5、5.、0.75、0.5 mg／L 9個不同質量濃度標準溶液，采用上述色譜條件分析。以樣品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得到線性回歸方程為：y＝33 434x－8 215.2，R2＝0.999 3，嘔吐毒素標準液在0.75～100 mg／L，線性關系良好。最低檢出限（S／N＝3）為0.02 mg／L，最低定量限（S／N＝10）為0.06 mg／L，見圖6。

圖5 不同NaCl質量濃度下啤酒中嘔吐毒素峰面積Fig.5 Deoxynivalenol peak area of beer under different NaCl concentration

圖6 嘔吐毒素標準曲線Fig.6 The standard curve of deoxynivalenol

2.2.2 精密度取30 mg／L的嘔吐毒素標準溶液，連續進樣9次，測定嘔吐毒素標樣色譜峰面積，考察標樣的RSD為0.98%；采用同樣的色譜條件檢測啤酒樣品處理溶液，測定樣品嘔吐毒素色譜峰峰面積，采用外標法定量，同一個樣品連續測定5次，計算樣品的RSD為1.58%。從上述結果可知，此檢測方法的RSD＜2%，精密度良好。

2.2.3 穩定性取某一污染啤酒樣品按照1.3.2方法預處理后，室溫下放置0、4、8、12、24、48 h后進樣，測定嘔吐毒素色譜峰峰面積，計算RSD為1.68%，表明供試溶液室溫放置48 h內基本穩定。

2.2.4 回收率分別取3種已知嘔吐毒素含量（采用競爭酶聯免疫法，通過嘔吐毒素試劑盒測定，視為標準含量，方法參照 GB／T5009.111－2003）的啤酒100 m L，分別添加30 mg／L的標準溶液1 m L，每種加標的啤酒樣作3次平行，按照本研究建立的方法測定，計算平均回收率，結果見表1。

表1 啤酒加標回收率Tab.1 Percent recovery of beer

通過對樣品進行加標測定，可以看出回收率在85.36%～96.92%范圍內，說明該方法準確性較好，基本可以保證測量結果的可靠性。

2.3 啤酒中嘔吐毒素質量濃度的檢測

按照作者所建立的方法檢測一系列啤酒中嘔吐毒素質量濃度（市售啤酒與染鐮刀菌麥芽釀制啤酒），結果見表2。

從表2可知，除了由染鐮刀菌麥芽釀制啤酒中嘔吐毒素的質量濃度相對較高，目前國內普通市售啤酒中嘔吐毒素質量濃度很低或者未檢出。雖然在很多國家已有不同的法規［10－11］，但是普遍限值在1 mg／kg，歐盟準備設定谷物重最高限值標準，德國政府通過了征求標準，谷物產品中的最高限值是0.5 mg／kg，但 是 面 包 和 相 關 產 品 則 為 0.35 mg／kg，荷蘭暫時允許的限值0.5 mg／kg，瑞士已規定谷物中的限值標準0.5 mg／kg。參照以上規定，本研究中HPLC方法的最低定量限為0.06 mg／L是可以滿足檢測要求的。

表2 不同啤酒中嘔吐毒素質量濃度Tab.2 Deoxynivalenol content of different beer

續表2

3 結語

采用反相高效液相色譜測定啤酒中嘔吐毒素，精密度、重復性、穩定性的RSD＜2%，回收率在85.36%～96.92%之間，方法簡便，成本較低，操作方便。準確度較高、精密度高，是分析啤酒中嘔吐毒素的有效方法。

（References）：

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Determination of Deoxynivalenol in Beer

PENG Xiao－bin，LI Xin－liang
（Shanghai Youtell Biochemical Co.，Ltd，Shanghai 201201，China）

An analytical method was developed to determine deoxynivalenol content in beer by high performance liquid chromatography in this study.Separations were achieved on a Zorbax Eclipose XDB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）in a linear gradient，and the mobile phase was a mixture of methanol and water with phosphoric acid（0.05%，v／v）at（20︰80，v／v.In addition，the column temperature was maintained at 30℃ with a flow rate of 1.0 m L／min.The detection wave length was set at 210 nm .There was a good linear relationship between 0.75 mg／L－100 mg／L（R2＝0.999 3）.The average recovery was between 85.36%～96.92%，and RSD was 4.21%.It was proved to be a convenient and accurate method for analyzing deoxynivalenol content in beer.

deoxynivalenol，beer，HPLC

TS 262.5

A

1673－1689（2012）04－0438－05

2011－05－01

彭曉斌（1984－），男，湖南婁底人，工學碩士，主要從事啤酒釀造方面的研究。E－mail：pxb212698＠163.com