高超氧化物歧化酶活性海洋紅酵母的篩選

王洛洋， 紀 政， 胡宗仁， 王璐思， 王曉蘭， 關洪斌

（山東大學 威海分校海洋學院，山東 威海 264209）

高超氧化物歧化酶活性海洋紅酵母的篩選

王洛洋， 紀 政， 胡宗仁， 王璐思， 王曉蘭， 關洪斌＊

（山東大學 威海分校海洋學院，山東 威海 264209）

為了提高海洋紅酵母超氧化物歧化酶的活性，尋找一種可以從眾多菌株中定向篩選超氧化物歧化酶高產菌株的方法，通過在培養基中添加百草枯并逐級提高、層層篩選，篩選出了超氧化物歧化酶活性較高的菌株并研究了不同程度的氧化脅迫對海洋紅酵母的生長狀況、超氧化物歧化酶活性及蝦青素質量分數的影響。結果表明：在百草枯濃度為0.075 mmol／L的條件下，可大大提高超氧化物歧化酶活性；經逐步提高百草枯濃度所篩選的菌株超氧化物歧化酶比活性提高35.2%；而所篩菌株在含0.075 mmol／L的百草枯培養基中培養后，超氧化物歧化酶比活性較初始菌株提高103.7%，差異顯著（p＜0.05）。這說明使用該方法可以達到篩選超氧化物歧化酶高產菌株的目的，而在培養基中添加低濃度的百草枯同樣可提高海洋紅酵母的超氧化物歧化酶活性。

海洋紅酵母；百草枯；超氧化物歧化酶；蝦青素；篩選

自從生物選擇了氧氣，新陳代謝大大加快，進化提速，但有氧代謝所產生的活性氧卻也不可免的會對機體造成傷害。為此，生物體進化出了酶促和非酶促反應兩套活性氧清除系統。超氧化物歧化酶（SOD，Superoxide Dismutase）和蝦青素（Astaxanthin）就分屬于以上兩套系統。超氧化物歧化酶（EC.1.15.1.1）是催化生物體中 O2－·分解，保護細胞免受損傷的一類金屬酶，廣泛存在于需氧和耐氧生物體內［1］，在臨床醫藥、食品、化妝品及農業、漁業等方面均有應用［2］。而蝦青素可有效淬滅單線態氧和清除自由基，其抗氧化能力是維生素E的100倍。紅酵母屬的一個顯著特征就是可產蝦青素。因而，對如何篩選高產蝦青素的海洋紅酵母的相關研究較多。同時，酵母菌作為單細胞真核微生物，細胞質內含真核生物特有的Cu，Zn－SOD，開發利用價值較大，因而酵母菌也被視為生產SOD的重點研究對象［3］。但目前對酵母菌的蝦青含量和SOD活性的綜合研究較少，且各高產菌株的篩選多采取直接從自然界篩選后經誘變處理，逐株檢測的方法。此法固然有效，但是工作量大，目的性不強，同時可能會是高產菌株因沒有被檢測到而流失。目前，尚沒有有關定向篩選高產SOD活性菌株方法的報道。

一種ROS（活性氧）的預處理使機體不僅耐受了這種特定的ROS，還能全面的耐受其他多種ROS，于是全面提高各種抗氧化酶活性［4］。Hassan等［5］發現百草枯對E.coli（大腸桿菌）中 Mn－SOD的表達有誘導作用。這是因為，百草枯（1，1－二甲基－4，4′－聯吡啶鎓鹽二氯化物）可在氧化還原反應中作為電子受體，在細胞內經呼吸鏈電子傳遞可產生氧自由基。而氧自由基的存在正好誘導了Mn－SOD的大量生成，從而使E.coli對百草枯的毒性具有抵御功能。但SOD對活性氧的清除能力是有限的，超過這個限度就會對機體產生傷害。據報道，Cu2＋可使蝦青素的合成降低而致使蝦青素低產菌株因失去保護而被淘汰，因此可將Cu2＋作為蝦青素高產菌株的篩選劑［6］。有鑒于此，作者通過研究不同百草枯濃度對海洋紅酵母得蝦青素質量分數、SOD活性等抗氧化性能指標及生物量的影響，旨在通過外加氧化脅迫淘汰抗氧化能力較低的菌株以期篩選得到抗氧化性能較高的菌株，并為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種實驗用海洋紅酵母菌種購自大連健洋生物科技有限公司。

1.1.2 培養基酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、陳海水1 000 m L、鏈霉素300 U／m L，上述培養基中加20 g瓊脂制成固體培養基。

1.1.3 試劑百草枯：四川西亞化工股份有限公司；鄰苯三酚、丙酮、異丙醇、鹽酸等：均為分析純。

1.1.4 儀器生化恒溫培養箱、搖床、752型紫外可見光分光光度計、SP－DJ系列凈化工作臺、電子分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養挑取菌種于斜面上28℃活化三代后（每代24 h），挑取兩環培養物接種于裝有40 m L液體培養基的150 m L錐形瓶中。28℃搖床擴培24 h后，以體積分數10%的接種量轉接至實驗各組的液體培養基中，28℃、150 r／min搖床培養3 d。

1.2.2 菌體收集將發酵培養基以3 000 r／min離心15 min后棄上清液，再水洗兩遍，每次以3 000 r／min離心10 min，棄上清液，收集得濕菌體，低溫烘干測干重。

1.2.3 SOD提取及酶活測定SOD釋放及酶活測定（微量鄰苯三酚法）參照文獻進行［7］。

1.2.4 蝦青素提取及質量分數測定參照文獻［8］。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的百草枯對海洋紅酵母生存的影響

在液體培養基中加入百草枯配成不同濃度梯度的培養基，培養50 h后于600 nm下測吸光度值，結果見圖1。從圖1可以看出：低濃度的百草枯不會對海洋紅酵母的生存構成威脅，但百草枯濃度超過0.2 mmol／L時，海洋紅酵母的細胞密度迅速下降。這表明海洋紅酵母的抗氧化能力存在一定的限度，超過該限度便不能生存。據報道，在0.4～1.0 mmol／L的百草枯濃度下，大腸桿菌的細胞密度隨濃度升高下降，超過1.2 mmol／L時幾乎不能生存［9］。這說明原核與真核生物的抗氧化能力存在較大差異。同時也表明，通過控制百草枯的濃度可以淘汰掉大部分菌株，進而有可能篩選得到抗氧化性能優越的菌株。

圖1 百草枯對海洋紅酵母生存的影響Fig.1 Effect of paraquat on the survival of Rhodotorula marina

2.2 不同百草枯濃度下海洋紅酵母的生長曲線

選擇了在百草枯濃度分別為0、0.075、0.150 mmol／L的條件下每8小時于600 nm處測吸光度值，繪制生長曲線，結果見圖2。由圖2可知：在較低的濃度下，百草枯不僅不會對海洋紅酵母的生長產生不良影響，反而可以加快其繁殖能力。相類似的是，有實驗結果表明，低濃度的O2－·可刺激敘利亞地鼠胚胎成纖維細胞的分裂能力［10］。因此，在實際生產中可以考慮有低濃度的氧脅迫加快生產菌株的分裂速度，縮短生產周期。

2.3 不同濃度的百草枯對海洋紅酵母SOD活性及蝦青素質量分數的影響

圖2 不同百草枯濃度下海洋紅酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of Rhodotorula marina under different paraquat concentration

在不同的百草枯濃度下，培養30 h后于600 nm處測吸光度值；培養72 h后分別測其SOD活性及蝦青素質量分數，結果見圖3，4。由圖3，4可以看出：SOD酶活、蝦青素質量分數以及海洋紅酵母的生物量會隨培養基中百草枯濃度的增加而波動。大約在百草枯濃度為0.075 mmol／L時，SOD酶活以及海洋紅酵母的生物量都較理想且蝦青素質量分數此時也可以接受。這與Bifeng Gao等［11］報道的20μmol／L的百草枯可顯著提高轉人類SOD基因的大腸桿菌Mn－SOD的合成相似，低濃度百草枯脅迫可以提高SOD比活。同時我們還發現，在培養30 h后，海洋紅酵母的OD600nm與SOD活性之間存在明顯相關性，在百草枯濃度低于0.075 mmol／L時，其線性相關系數R2＝0.984。在培養30 h后海洋紅酵母的生長進入對數期，其OD600nm值可反映其細胞分裂速度。因此，在SOD與細胞分裂間可能存在某種聯系。

圖3 不同濃度的百草枯對海洋紅酵母抗氧化性能的影響Fig.3 Antioxidants of Rhodotorula marina under different concentration of paraquat

圖4 SOD活性與生物量間的相關性Fig.4 Correlation between SOD and biomass

2.4 高抗氧化性菌株的篩選試驗

鑒于以上結果，以10%接種體積分數依次轉接至含有百草枯濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mmol／L的培養基中，每輪于28℃、150 r／min搖床培養30 h。此時于顯微鏡下鏡檢發現大部分酵母細胞已死亡，存活細胞的濃度較低。因而，作者直接以每平板200μL的量將培養液進行涂布培養，挑選生長旺盛的單個菌落進行傳代培養并保藏。以不加百草枯的培養基中培養初始菌株作對照，將所分離得到的菌株分別在不含百草枯和百草枯濃度為0.075 mmol／L的條件下進行試驗，培養72 h后分別檢測各組SOD活性及蝦青素質量分數（每組3個平行，結果以M±SD表示），結果見表1。

表1 百草枯處理對海洋紅酵母抗氧化性能的影響Tab.1 Antioxidants of Rhodotorula marina treated with paraquat

采用SPSS進行顯著性t檢驗，結果表明：所篩菌株在相同條件下（即不含百草枯）培養后與初始菌株相比其生物量、蝦青素質量分數及產量均顯著下降（p＜0.05）；而于0.075 mmol／L的百草枯濃度下培養的所篩菌株的生物量、蝦青素質量分數及產量與對照相比下降均極顯著（p＜0.01）。將分離得到的菌株經兩次轉接后鏡檢，仍有大量細胞死亡，其中大多為未成熟的芽體。據此推測：出現生物量下降的原因可能是長期的氧化脅迫產生的大量自由基破壞了酵母遺傳物質，使部分受損傷較嚴重的細胞不能正常分裂的結果；那么存活下來的很可能是經修復的突變細胞或本身抗氧化能力較強的細胞。所篩菌株的蝦青素含量出現顯著下降，表明經多次傳代培養的所篩菌株細胞內可能仍維持一定的百草枯濃度并對正常的細胞代謝產生影響。但是，所篩選的海洋紅酵母SOD比活與對照相比升高35.2%，而于0.075 mmol／L的百草枯濃度下培養的所篩菌株SOD比活與對照相比升高103.7%，差異顯著（p＜0.05）。可能是由于上述試驗的各組菌株均來源于同一株初始海洋紅酵母菌株，即種內變異較小，因而所篩菌株的SOD比活性雖有提高但差異不顯著。也可能是由于所篩選出的菌株確與初始菌株存在較大差異，但表現出這種差異的條件是一定的氧化脅迫?？寡趸锩覆粌H直接受到其作用底物的誘導，還受到非作用底物的交叉誘導，如O2－·不僅使SOD活性上升，也使過氧化氫酶活性上升［4］。這也是于0.075 mmol／L的百草枯濃度下培養的所篩菌株SOD比活與對照相比顯著升高的可能原因。因而，較理想的獲得高產SOD海洋紅酵母的思路為：先采用常規的物理化學誘變方法進行誘變以增加初始菌株的變異度，再用逐級提高百草枯濃度的方法篩選出高SOD活性的變異菌株，最后施以微量的百草枯以誘導該性狀的表現。

3 結語

目前，誘變的方法很多，但如何從誘變處理的菌株中選擇出所需要的性狀通常比較繁瑣。本研究結果表明，相對較高的百草枯脅迫可以淘汰大部分的海洋紅酵母而篩選出SOD活性較高的菌株；而相對較低的百草枯濃度（0.075 mmol／L）對海洋紅酵母的生存無影響，但卻可以提高SOD活性。盡管百草枯是一種毒性較強的農藥，但是由于所需量極少即可提高SOD活性，且其對魚類等低毒；因而可以考慮將百草枯作為發酵條件研究，在提取SOD時去除百草枯即可或是考慮將酵母直接用于魚類等的餌料。

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Screening ofRhodotorula marinaof High Superoxide Dismutase Activity

WANG Luo－yang，JI Zheng，HU Zong－ren，WANG Lu－si，WANG Xiao－lan，GUAN Hong－bin

（College of Marine，Shandong University at Weihai，Weihai 264209，China）

To improve the superoxide dismutase activity of Rhodotorula marina，a screen method with paraquat as drug was introduced in this study.Though gradually increasing of paraquat content in medium，a stain with of high superoxide dismutase activity（increased by 35.2%）was screened.Based on this，the effect of different oxidative stress to the growth，superoxide dismutase activity and astaxanthin content was investigated.The results indicated that 0.075 mmol／L paraquat could improve the superoxide dismutase activity by 103.7%when compared with that of the control，（p＜0.05）.This shows that this method can achieve the purpose of screening strain with high superoxide dismutase activity，and culturing with low concentrations of paraquat can also improve the superoxide dismutase activity ofRhodotorula marina.

Rhodotorula marina，paraquat，superoxide dismutase，astaxanthin，screening

TQ 926

A

1673－1689（2012）04－0433－05

2011－04－11

山東大學威海分?？蒲辛㈨楉椖浚ˋ10026）。

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關洪斌 （1961－），男，黑龍江依蘭人，理學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事逆境生理、基因表達、餌料誘食劑研究。E－mail：guanhongbin＠sdu.edu.cn