真姬菇JB06發酵海帶廢渣所得產物的抗自由基和總抗氧化能力

解秋菊， 閆培生， 池振明

（1.哈爾濱工業大學 （威海）海洋學院，山東 威海 264209；2.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266003）

真姬菇JB06發酵海帶廢渣所得產物的抗自由基和總抗氧化能力

解秋菊1， 閆培生1， 池振明2

（1.哈爾濱工業大學 （威海）海洋學院，山東 威海 264209；2.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266003）

為了探索海帶廢渣高附加值利用的方法，用真姬菇JB06菌株液態發酵海帶廢渣，乙醇沉淀法制備發酵液上清液中多糖，用試劑盒測定了所得多糖的抗自由基和總抗氧化能力。結果表明：在多糖質量濃度為0.5 mg／m L時，真姬菇JB06菌株發酵上清液中的多糖（簡稱JB06菌株多糖）對羥自由基的抑制率比海帶廢渣水溶液上清中的多糖（簡稱對照多糖）高了11.34%；多糖質量濃度為8 mg／m L時，JB06菌株多糖對超氧陰離子自由基的抑制率比對照多糖高了9.52%；JB06菌株多糖的總抗氧化能力比對照多糖高出了13.20%。通過實驗可以得出：真姬菇發酵海帶廢渣后獲得的多糖的總抗氧化能力比對照多糖總抗氧化能力顯著提高。

真姬菇；液態發酵；海帶廢渣；多糖；抗自由基；總抗氧化能力

海帶作為海藻的一種，是海藻工業的主要原料之一，目前在我國已形成了一個以褐藻膠、甘露醇、碘為主要產品的海藻化工業，產業規模居世界首位。按干物質計，海帶的工業利用率僅為30%，還有約2／3的海帶成分尚未得到利用，而是作為廢棄物扔掉，不僅浪費了大量的自然資源，還帶來一系列環境污染問題［1］。

真姬菇（Hypsizigus marmoreus），俗稱玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇等，它隸屬擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，白蘑科，玉蕈屬，是一種較為珍稀的藥食兩用菌［2］。其多糖具有防癌抗癌、抵抗HIV病毒、降血壓、清除體內自由基、提高免疫力等功效［3］。隨著人們對液體培養技術研究的不斷深入，液體培養已被成功地用于多種大型真菌的大規模生產［4］。研究發現，真姬菇在液體培養過程中能夠在細胞內、外同時積累多糖［5］。現代研究表明：許多食用真菌所含成分（如多糖等）具有免疫調節活性［6］。作者以真姬菇做菌種，液體發酵海帶廢渣，研究了所得多糖的抗自由基和總抗氧化能力，為真姬菇的液體發酵和海帶廢渣的再利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測試盒、總抗氧化能力（T－AOC）測定試劑盒：均購自南京建成生物工程研究所；海帶廢渣：榮成市尋山漁業公司；真姬菇JB06菌株：作者所在實驗室篩選保存。

4K－15高速冷凍離心機：德國Sigma公司制造；Alpha1－2／LD－plus冷凍干燥機：德國Christ公司制造；MK3酶聯免疫分析儀：美國熱電Thermo。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

1）菌種斜面和平板培養基（g／d L）：PDA培養基，含馬鈴薯20，葡萄糖2，瓊脂粉1.8，p H自然。121℃滅菌30 min。

2）5%海帶廢渣液體培養基：將海帶廢渣磨成干粉，配制成5%的水溶液，同時添加0.025 g／d L的蛋白胨和0.005 g／d L的硫酸鎂，p H自然，各做3個平行，121℃滅菌30 min。

1.2.2 接種、培養與處理將實驗菌株從斜面上挑取一小塊接種到平板中央，25℃恒溫培養。待菌絲體長到一定程度，用直徑為10 mm無菌打孔器從平板上打孔取塊，分別接種于海帶廢渣液體培養基，放入搖床，25℃、110 r／min恒溫振蕩培養，以無菌的、不接種的海帶廢渣液體培養基作為空白對照。10 d后，將發酵產物于4 000 r／min離心10 min，收集上清液，然后加入3倍體積的無水乙醇，混勻，4℃靜置過夜后，5 000 r／min離心20 min，沉淀用95%乙醇洗2次后，－20℃冷凍，冷凍干燥機中凍干，得到粗多糖。

1.2.3 苯酚硫酸法測多糖質量濃度標準曲線的繪制：取11支帶塞的玻璃試管，依次加入0.100 mg／m L的葡萄糖標準液 0、0.1、0.2、0.3、0.4 、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 m L，然后加入蒸餾水補足到1 m L，加入5%的苯酚1.0 m L，豎直加入濃硫酸5 m L，振蕩混勻，然后100℃水浴中反應10 min，冷卻至室溫，在490 nm波長下測定吸光值。

將粗多糖水溶液稀釋到合適的濃度，加入1.0 m L，其它操作同標準曲線繪制方法，將吸光度值利用標準曲線算出溶液中多糖的質量濃度，此數值乘0.9，即為純多糖量。

1.2.4 多糖清除羥自由基能力測定將對照多糖、JB06菌株多糖分別用蒸餾水配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0 mg／m L系列濃度，按試劑盒說明書提供的方法進行測定，每個質量濃度做3個平行，用酶標儀550 nm處測吸光度。

1.2.5 多糖清除超氧陰離子自由基能力測定 將對照多糖、JB06菌株多糖分別用蒸餾水配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mg／m L系列質量濃度，按試劑盒說明書提供的方法進行測定，每個質量濃度做3個平行，用酶標儀550 nm處測吸光度。

1.2.6 多糖總抗氧化能力測定將對照多糖、JB06菌株多糖分別用蒸餾水配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 mg／m L系列質量濃度，每個質量濃度做3個平行，用酶標儀520 nm處測吸光度。按試劑盒說明書提供的方法進行測。

2 結果與分析

2.1 多糖質量濃度

葡萄糖標準曲線為Y＝10.342X－0.000 2，R2＝0.999 5，其中，Y為490 nm處的吸光光度值，X為葡萄糖質量濃度。對照粗多糖和JB06菌株粗多糖的質量濃度測定結果見表1。

表1 多糖質量濃度測定結果Tab.1 Content of polysaccharides in fermented broth

從表1的實驗結果可以看出，JB06菌株多糖質量濃度明顯高于對照多糖。

2.2 多糖清除羥自由基能力的比較

JB06菌株多糖清除羥基自由基的能力高于對照多糖，且抑制率隨著多糖質量濃度的增大而增加。JB06菌株多糖在質量濃度為0.1～0.5 mg／m L時其抑制率增加較慢，當大于0.5 mg／m L時，抑制率從40.78%很快升至60.31%；對照多糖的抑制率隨著多糖質量濃度的升高逐漸增加。李正鵬、吳萍［7］研究了白靈菇胞外多糖抗氧化活性，對羥自由基的抑制率也是隨著多糖質量濃度的增加而增高，在4 mg／m L時抑制率為39.56%，低于本實驗的結果，JB06菌株多糖此質量濃度的抑制率為70.56%，見圖1。

圖1 對照多糖、JB06菌株多糖的清除羥自由基測定結果Fig.1 Clean free radical activity of polysaccharides from strain JB06 broth

從圖1的實驗結果得知，在0.5 mg／m L時，JB06菌株多糖與對照多糖的抑制率差別最小，因此，在該多糖質量濃度下，對JB06菌株多糖和對照多糖的抑制率做t檢驗﹙p＞0.05差異不顯著；0.05＜p＜0.01差異顯著；p＜0.01差異極其顯著﹚，p＝0.002，差異極其顯著，從而得知，在其它多糖質量濃度下JB06菌株多糖與對照多糖的抑制率差異都極其顯著。

2.3 多糖清除超氧陰離子自由基能力的比較

JB06菌株多糖清除超氧陰離子自由基的能力明顯高于對照多糖。JB06菌株多糖在低質量濃度范圍內，抑制率隨質量濃度的升高而增強，多糖質量濃度從2 mg／m L升至8 mg／m L時，抑制率增加較快，從8.83%升至25.71%，多糖質量濃度大于8 mg／m L時，抑制率增加很慢，在16 mg／m L時，抑制率僅為32.14%。對照多糖對超氧陰離子自由基的抑制率隨質量濃度的變化與JB06菌株多糖相似。李順峰等［8］報道真姬菇子實體多糖體外抗氧化特性研究表明，真姬菇子實體多糖粗品對超氧陰離子自由基有一定清除效果，在質量濃度為10 mg／m L時抑制率達到最高，約30%左右，本實驗結果與其一致，見圖2。

圖2 對照多糖、JB06菌株多糖的抗超氧陰離子自由基測定結果Fig.2 Anti－free radical activity of polysaccharides from strain JB06 broth

從實驗結果得知，多糖質量濃度為2 mg／m L時，JB06菌株多糖與對照多糖的抑制率差別最小，因此，在該多糖質量濃度下，對JB06菌株多糖和對照多糖的抑制率做t檢驗，p＝0.004，差異極其顯著，從而得知，在其它多糖質量濃度下JB06菌株多糖與對照多糖的抑制率差異都極其顯著。

2.4 多糖總抗氧化能力的比較

從圖3可以看出，JB06菌株多糖的總抗氧化能力隨多糖質量濃度的增加有一定的變化。在1 mg／m L和2 mg／m L時，總抗氧化能力達到最高，為2.050 U／mg，當多糖質量濃度繼續增加時，其總抗氧化能力則減少。多糖質量濃度為6 mg／m L時，總抗氧化能力減少為1.401 U／mg，因此，JB06菌株多糖的總抗氧化能力為2.050 U／mg；對照多糖的總抗氧化能力也表現出與JB06菌株多糖相似的趨勢，在多糖質量濃度為0.4～2 mg／m L范圍內，總抗氧化能力逐漸增加，當多糖質量濃度為2 mg／m L時，總抗氧化能力達最高，為1.811 U／mg，多糖質量濃度繼續增加時，總抗氧化能力則逐漸降低。因此，對照多糖的總抗氧化能力為1.811 U／mg。JB06菌株多糖的總抗氧化能力比對照多糖高了13.2%。

對JB06菌株多糖和對照多糖的抗氧化能力單位做t檢驗，p＝0.030，差異顯著。

3 結語

作者測定了真姬菇液態發酵海帶廢渣所得多糖清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基和總抗氧化能力，通過實驗得出：真姬菇JB06菌株多糖清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基和總抗氧化能力都比對照多糖的高，真姬菇對海帶廢渣的發酵有明顯的效果。

圖3 對照多糖、JB06菌株多糖的總抗氧化能力測定結果Fig.3 Total antioxidant activity of polysaccharides from strain JB06 broth

（References）：

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Anti－Free Radical and Antioxidant Activity of Exopolysaccharide from Fermented Kelp Waste byHypsizigus marmoreusJB06

XIE Qiu－ju1，YAN Pei－sheng1，CHI Zhen－ming2

（1.School of the Ocean，Harbin Institute of Technology at Weihai，Weihai 264209，China；2.College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The aim of this study is to find a way to reuse of kelp waste with higher value.For this，kelp waste was fermented in liquid byHypsizigus marmoreusJB06，and the polysaccharides were got through sedimentation by ethanol.The activity of anti－free radical and total antioxidant of polysaccharides was detected by using the Kit.The results showed that at the 0.5 mg／m L，the inhibition rate of hydroxyl radical of the polysaccharide was higher by 11.34%than that from the solution of pure kelp waste.At the content of 8mg／m L，the inhibition of superoxide anion was higher by 9.52%than that from the solution of pure kelp waste；the total antioxidant activity was increased by 13.20%.Based on the above results，it can conclued that the antioxidant capacity was significantly increased by fermentation.

Hypsizigus marmoreus，liquid fermentation，kelp wast，polysaccharide，anti－free radical，antioxidant activity

＊通信作者：閆培生（1964－），男，山東棲霞人，農學博士，教授，博士研究生導師，主要從事微生物方面的研究。E－mail：psyan6＠hotmail.com

TQ 920.1

A

1673－1689（2012）04－0429－04

2011－02－25

山東省自然科學基金項目（ZR2010DQ010）。

解秋菊（1972－），女，山東荷澤人，工學碩士，高級工程師，主要從事生物技術方面的研究。E－mail：whxqj＠yahoo.com