同位素稀釋氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海產(chǎn)品中的苯并(a)芘的殘留量*

王建華 ，宮萍 ，田良良 ，王興華 ，楊君 ，王境堂

（1.山東出人境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，山東青島 266002； 2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003； 3.青島大學(xué)，山東青島 266071）

同位素稀釋氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海產(chǎn)品中的苯并(a)芘的殘留量*

王建華1，宮萍1，田良良2，王興華1，楊君3，王境堂1

（1.山東出人境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，山東青島 266002； 2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003； 3.青島大學(xué)，山東青島 266071）

采用同位素稀釋法結(jié)合固相萃取凈化，建立了海產(chǎn)品中苯并(a)芘殘留的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS／MS)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈-丙酮（體積比6∶4）溶液提取，硅膠固相萃取凈化，苯并(a)芘用GC-MS／MS測(cè)定，同位素D12-苯并芘內(nèi)標(biāo)法定量。方法的平均回收率為93%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%～12.2%(n=6)，定量限為0.2μg／kg。用該方法測(cè)定FAPAS煙熏魚有證標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值一致。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；苯并(a)芘；海產(chǎn)品；同位素稀釋

多環(huán)芳烴是一類環(huán)境污染物，通過環(huán)境介質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)［1］，其中苯并(a)芘(BAP)是其中的代表物質(zhì)，許多國(guó)家或地區(qū)對(duì)其有嚴(yán)格的限量規(guī)定。2011年6月中國(guó)渤海中南部海域的蓬萊19-3油氣田發(fā)生漏油事件后，引起國(guó)內(nèi)外的高度關(guān)注。石油中含有苯并(a)芘，為此，7月韓國(guó)農(nóng)林水產(chǎn)省向各檢驗(yàn)檢疫所緊急下達(dá)了蛤蜊、安康魚、章魚、梭子蟹等中國(guó)進(jìn)口的此水域水產(chǎn)品中苯并(a)芘的檢測(cè)計(jì)劃，并且通報(bào)中國(guó)，因此，我國(guó)亟需開展常規(guī)檢測(cè)方法研究。韓國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)中魚類苯并(a)芘含量需低于2.0 μg／kg，蛤蜊需低于 10.0 μg／kg，軟體和甲殼類需低于5.0 μg／kg。對(duì)于水產(chǎn)品中苯并(a)芘，歐盟指令1881／2006 EC規(guī)定限量分別為2 μg／kg，煙熏水產(chǎn)品為 5 μg／kg［2］，中國(guó) GB 2762-2005《食品污染物限量》規(guī)定的限量為10.0 μg／kg。

有關(guān)水（海）產(chǎn)品中苯并(a)芘或多環(huán)芳烴測(cè)定方法主要有高效液相色譜熒光法［3-5］，氣相色譜-質(zhì)譜法［6-9］，氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法［10］。

筆者通過條件優(yōu)化后選擇乙腈-丙酮溶液提取海產(chǎn)品中苯并(a)芘，硅膠柱凈化；采用GC-MS／MS測(cè)定保證了定性結(jié)果的可靠性并提高了靈敏度；通過添加同位素到樣品中作為分析質(zhì)量控制和定量測(cè)定的手段，保證了定量結(jié)果的可靠性。應(yīng)用于FAPAS煙熏魚有證標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定，測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值一致。該方法簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確,已用于海產(chǎn)品中苯并(a)芘常規(guī)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜儀：TSQ QuantumGC型，帶電子轟擊電離源（EI），美國(guó) Thermofisher公司；

水平震蕩器：HS501型，德國(guó)IKA公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BUCHI R-200型，瑞士Buchi公司；

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 mg／mL，0～4℃避光保存，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

D12-苯并芘：純度大于99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

硅膠固相萃取柱：agela cleanert silica-SPE(1000 mg，6 mL)，天津博納艾杰爾公司；

乙腈、丙酮、環(huán)己烷：HPLC級(jí)；

氯化鈉：分析純。

1.2 GC-MS／MS分析條件

（1）色譜條件

色 譜 柱：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；溫度程序：70℃（2 min），以25℃／min升溫至140℃，以10℃／min升溫至240℃，然后再以5℃／min升溫至300℃（5 min）；載氣：He，純度不小于99.999%，流速為1 mL／min；進(jìn)樣口溫度：270℃。

（2）質(zhì)譜條件

傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃，Q2碰撞氣：氬氣；無(wú)分流進(jìn)樣，1 min后打開分流閥；進(jìn)樣量：1.0 μL；離子化模式：CEI，正離子掃描；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；溶劑延遲：5 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將海產(chǎn)品去殼，去骨，取可食用的部分絞碎均勻。稱取4 g絞碎后的樣品，加入400 μL內(nèi)標(biāo)D12-苯并芘，加入20 mL乙腈-丙酮（體積比6∶4）均質(zhì) 2 min，用10 mL乙腈-丙酮（體積比6∶4）清洗均質(zhì)機(jī)后合并入相應(yīng)的提取離心管中，震蕩10 min，加入過量的氯化鈉，以5 000 r／min離心10 min，將15 mL上清轉(zhuǎn)移入干凈的離心管中，-70℃靜置20 min，將上清轉(zhuǎn)移入梨形瓶，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈桑? mL環(huán)己烷溶解。

Silica SPE柱預(yù)先用5 mL環(huán)己烷活化，將樣品過柱，收集過柱液，梨形瓶中加入5 mL環(huán)己烷清洗過SPE柱，另外用15 mL環(huán)己烷淋洗SPE柱，合并所有過柱液，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈桑? mL環(huán)己烷定容，轉(zhuǎn)移入樣品瓶，供GC-MS／MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

水產(chǎn)品中樣品前處理方法包括：皂化后，正己烷或環(huán)己烷提取，硅膠或 florisil固相萃取柱凈化［3-5，8］；章汝平等［9］采用正己烷-二氯甲烷索氏提取后，硅膠凈化；Jalal Hassan etal［7］采用乙腈均質(zhì)提取，GPC 凈化。

文獻(xiàn)［11］選擇用乙腈-丙酮(60∶40)混合溶液作為溶劑均質(zhì)提取。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，選擇硅膠固相萃取柱作為凈化柱，環(huán)己烷為洗脫劑。凈化前鹽漬蛤蜊提取液呈深黃色，凈化后定容溶液呈淡黃色。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

GC-MS／MS在SRM檢測(cè)模式下具有很好的選擇性和專屬性，已經(jīng)用于農(nóng)殘等的分析［13］。質(zhì)譜條件優(yōu)化首先用進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描分析，獲得保留時(shí)間[苯并(a)芘22.62 min，D12-苯并芘22.54 min]和一級(jí)質(zhì)譜圖，選擇其中豐度比高的母離子做子離子掃描，得到二級(jí)質(zhì)譜。苯并(a)芘和D12-苯并芘，在全離子掃描模式下分別得到豐度最高的分子離子m／z252、264，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描，按照歐盟指令［13］，對(duì)于 GC-MS／MS，一個(gè)母離子，2個(gè)子離子4個(gè)識(shí)別點(diǎn)滿足定性要求，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及豐度比：m／z252／250(100)、m／z252／226(6.5)，同位素D12-苯并芘得到離子對(duì)：m／z264／260(100)、m／z260／232(23)，260／236(3)，優(yōu)化后的碰撞能量為40，獲得m／z較大且豐度最大的子離子對(duì)252／250和264／260為定量離子對(duì)。各離子對(duì)駐留時(shí)間均為 100 ms。改變掃描寬度（m／z）0.02，0.05，1.00，根據(jù)信噪比選擇0.02最佳。改變掃描時(shí)間分別為0.02，0.05，0.08，1 s，信噪比逐漸增大，考慮到峰形，選擇最佳掃描時(shí)間為0.08 s。

2.3 方法學(xué)的參數(shù)

GC-MS／MS法：分別配制濃度為0.2～20 ng／mL 9個(gè)水平的苯并(a)芘和等濃度的D12-苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以苯并(a)芘與內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)色譜峰面積比(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。苯并(a)芘在相當(dāng)于0.1～10 μg／kg范圍內(nèi)符合線性關(guān)系，線性方程為Y=0.418X-0.052 3，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。進(jìn)樣0.4 ng

／mL(0.2 μg／kg)時(shí)，信噪比S／N大于 10，規(guī)定GC-MS／MS法的定量限(LOQ)為0.2 μg／kg。

采用本方法對(duì)章魚、蛤蜊和安康魚陰性樣品中苯并(a)芘添加兩水平進(jìn)行6次分析，內(nèi)標(biāo)法定量。方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，采用用本方法對(duì)在有效期內(nèi)的FAPAS煙熏魚醬T0642有證標(biāo)準(zhǔn)樣品［14］進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可以看出，測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值一致，進(jìn)一步證明所建立的方法可靠。

表2 FAPAS 樣品的分析結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

采用SPE結(jié)合GC-MS／MS檢測(cè)海產(chǎn)品中苯并(a)芘，靈敏度和準(zhǔn)確度滿足殘留檢測(cè)的要求，可以用于不同種類的海產(chǎn)品中苯并(a)芘檢測(cè)。

［1］趙文昌，程金平，謝海，等.環(huán)境中多環(huán)芳烴(PAHs)的來(lái)源與監(jiān)測(cè)分析方法［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2006，29(3): 105-107.

［2］COMMISSION REGULATION (EC)No 1881／2006 of 19 December 2006 Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs［S］.

［3］SC／T 3041-2008 水產(chǎn)品中苯并(a)芘的測(cè)定 高效液相色譜法［S］.

［4］黃鸞玉，黎小正，秦振發(fā).固相萃取／高效液相色譜熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中苯并(a)芘［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28(12): 63-65.

［5］Pena T，Pensado L，Casais C，et al. Optimization of a microwaveassisted extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons from fish samples［J］.J Chromatogr A，2006，1121(2): 163-169

［6］Ramalhosa M J，Paíga P，Morais S，et al. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe extraction method［J］.J Sep Sci，2009，32: 3 529-3 538.

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［8］楊家鋒，鐘惠英，段青源.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中 16種多環(huán)芳烴［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(10):2 291-2 295.

［9］章汝平，郭萍，李錦輝.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肉松、魚干中的多環(huán)芳烴［J］.食品科技，2008，(6): 213-217.

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［11］王建華，郭翠，龐國(guó)芳，等.GPC凈化-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)定量GC-MS對(duì)植物油中多環(huán)芳烴的測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28(3): 267-271.

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［13］2002／657／(EC): EU Commission decision of 12 August 2002 implementing council directive 96／23／EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results(Text with EEA relevance)(notified under document number C(2002)3044).Official Journal of the European Communities L 221，17／08／2002.

Determination of Benzo(a)pyrene in Seafood by Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry with Isotope Dilution

Wang JianHua1， Gong Ping1， Tian Liangliang2， Wang Xinghua1, Yang Jun3， Wang Jingtang
(1. Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao 266002， China ； 2. Ocean University of China，Qingdao 266002， China；3. Qingdao University， Qingdao 266071， China)

An analytical method for the determination of Benzo(a)pyrene in seafood was developed by isotope dilution gas chromatography tandem mass spectrometry(GC-MS／MS). Sample was extracted by using acetonitrileacetone mixture as solvent，purged by silica solid phase extraction column and analyzed by GC-MS／MS under selective reaction monitoring mode. Three deuterated surrogate standards Benzo(a)pyrene-D12 were used as internal standards for quantification and analytical quality control. The limit of quantification(LOQs) was 0.2 μg／kg，the recoveries ranged from 93% to 98%， and the relative standard deviations were 6.2%-12.2%(n=6). The method was used to determine the quality control materials T0642 provided by the FAPAS and the results were consistent with standard values.

gas chromatography-tandem mass spectrometry; benzo(a)pyrene; seafood; isotope dilution

O657.7+1

A

1008-6145(2012)01-0024-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.007

*國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK222）

聯(lián)系人：王建華；E-mail: whywrs@yahoo.com.cn

2011-11-08