腫瘤患者化療前后外周血NK/T及Treg細胞比例分析

沈彥偉 高旭霞 李晶晶 譚純文 袁瑛

腫瘤具有免疫逃逸功能是其典型生物學特性之一，其免疫逃逸的機制一直是腫瘤免疫領域的研究熱點，目前主要歸結于腫瘤弱抗原性和腫瘤的免疫抑制效應所致。機體無法激起正常的免疫應答來清除腫瘤細胞的原因，與腫瘤微環境中局部富集的免疫抑制性細胞(如Treg、MDSC、M2巨噬細胞等)，降低了有效的抗腫瘤免疫反應有關。人體免疫系統的獲得性免疫防御機制包括體液免疫和細胞免疫，在抗腫瘤免疫中起主導作用的是細胞免疫。T細胞是介導細胞免疫的中心環節，但1995年前后有學者研究發現，CD4陽性T淋巴細胞中有一群表面標志CD25陽性的細胞即CD4+CD25+T細胞，不僅不能“輔助”免疫反應，反而有顯著抑制作用，將其命名為調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)[1-3]。近年來，國內外都已有報道，腫瘤患者血液及瘤體組織中，Treg細胞的數量明顯高于正常人，揭示了腫瘤免疫微環境的本質[1，4]。腫瘤患者外周血中增加的Treg細胞究竟來源何處？有文獻表明，Treg細胞分為兩類，其都表達CD4、CD25和FoxP3基因，一類是在胸腺T細胞成熟過程中自然發生的nTreg(natural Treg)；另一類是在T細胞成熟過程中，幼稚型T細胞經細胞因子(TGF-β和retinoic acid)誘導分化而來的iTreg(induced Treg)[5]。結合腫瘤細胞高表達并分泌TGF-β這一現象，有學者認為，在腫瘤原位的浸潤淋巴細胞中(tumor infiltrated lymphocyte，TIL)存在大量由腫瘤誘導產生的iTreg細胞，從而形成免疫抑制性微環境[6]。這一發現給腫瘤免疫逃逸學說提供了依據。而有關腫瘤微環境中其他免疫細胞(如巨噬細胞MΦ，樹突狀細胞DC等)調控腫瘤免疫逃逸的研究也已經大量報道[7-10]。

腫瘤的化療具有一定免疫調節功能，已有多篇文獻報道，化療藥物不僅可增強腫瘤細胞的免疫原性，而且還能通過影響免疫細胞的功能來提高機體的抗腫瘤免疫反應。但需特別注意的是，某些化療藥物也可能造成Treg增殖反彈。荷瘤小鼠使用大劑量伊立替康聯合氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸時，Treg數目在淋巴細胞恢復期顯著上升。那么，Treg細胞在化療減輕瘤負荷及手術切除腫瘤的過程中，在腫瘤患者體內是否隨著腫瘤的負荷而產生數目及功能的相應變化？手術或化療之后，腫瘤微環境的改變，對機體整體的自然殺傷細胞(natural killer,NK)、CD4/CD8T細胞、Treg細胞是否產生了一系列的調節？本文旨在探討腫瘤患者化療前后，外周血免疫激活細胞及免疫抑制細胞比例變化。

材料與方法

一、材料

1.人源標本：病例選自2010年2月至2012年2月在本院腫瘤科住院的晚期惡性腫瘤患者(肺癌、腸癌、乳癌、食道癌、胃癌)共140例，其中包括結直腸癌31例、胃癌21例、肺癌61例、乳腺癌27例，腫瘤患者化療前、化療1次后、2次后、3次后、4次后、5次后外周靜脈血。其中男性80例，女性50例；年齡28～81歲，中位年齡57歲。同時從門診體檢部門獲得38例健康人的血樣作為對照組的設立。年齡15～81歲，中位56歲，其中男23例，女15例，均排除糖尿病、甲亢、甲減、腫瘤等疾病。

2.流式細胞術用試劑：APC-anti-hCD4、FITC-anti-hCD8、PE-anti-hCD3、FITC-anti-hCD4、PECy5-anti-hCD127、FITC-anti-hCD3、PE-anti-hCD 56及PE-anti-hCD25(eBioscience)；PBS(pH 7.4)：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，無水Na2HPO41.44 g，無水KH2PO40.24 g，雙蒸水1 L溶解，調整pH值，高壓滅菌。取BD肝素抗凝的外周血2 ml，室溫下孵育15 min，PBS洗滌2次，用流式細胞儀(Becton Dickson FACSCalibur,USA)檢測，Cellquest軟件分析數據，記錄陽性細胞百分率，減去非特異對照值。

二、方法

流式細胞術分析：所有健康人外周血、惡性腫瘤患者外周血樣本均為EDTA抗凝血(BD)，加紅細胞裂解液，分離得到的PBMC懸液。首先使用預冷PBS洗滌2遍，再經4℃抗體孵育30 min染色后，離心PBS洗滌一次。使用200 μl PBS重懸細胞，FCM流式細胞術分析患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比例及CD4+T細胞中Treg細胞的比例及NK細胞比例。使用的抗體列于下方：APC-anti-hCD4、FITC-anti-hCD8、PE-anti-hCD3、FITC-anti-hCD4、PECy5-anti-hCD127、FITC-anti-hCD3、PE-anti-hCD5及PE-anti-hCD25(eBioscience)流式分析所用儀器為FACSCalibur，軟件使用Cell Quest。所有實驗均重復三次以保證系統穩定性。

三、統計學分析

SPSS 18.0版軟件進行統計分析，采用獨立樣本t檢驗，比較腫瘤患者與健康對照組的外周血中Treg及NK細胞量。用重復測量方差分析，比較腫瘤患者化療前后外周血中Treg及NK細胞比例的變化。3次重復實驗得到的比值平均數進行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.腫瘤患者外周血中NK細胞及Treg比例均顯著高于健康對照組統計結果顯示(圖1，表1)，采集的69例初次確診的惡性腫瘤患者外周血中NK細胞比例(18.56%±9.19%)要顯著高于健康人(12.37%±6.24%)，Treg細胞比例(6.95%±8.96%)也顯著高于健康對照組(4.25%±2.59%)。

2.腫瘤患者化療過程外周血中NK細胞及Treg比例的變化趨勢：統計學分析顯示(表2)，對69例腫瘤患者化療過程后續隨訪中發現，外周血中NK細胞比例以及Treg細胞比例雖然有些變化，而且一直高于化療前水平，但隨著化療進程，NK細胞以及Treg的比例變化差異無統計學意義。CD4+T輔助細胞與CD8+T殺傷細胞的百分比和比例變化差異無統計學意義。

針對患者所患腫瘤不同進行分層分析，發現不同的惡性腫瘤，化療期間CD4+輔助性T細胞、CD8+殺傷性T細胞、CD4+CD25highCD127-調節性T細胞及CD3-CD56+NK細胞百分比有不同的變化趨勢：在結直腸癌、胃癌患者中發現，CD4+輔助性T細胞、CD4+CD25highCD127-調節性T細胞，在化療前呈較高水平，隨著化療的進行，有著先降低后升高的趨勢，而CD8+細胞毒性T細胞在化療前呈低水平。隨著化療的進行，有著先升高后降低的趨勢，同時天然免疫殺傷細胞NK在化療過程中也出現了先升高后降低趨勢。

而在肺癌及乳癌患者的化療過程中，CD4+輔助性T細胞、CD4+CD25highCD127+調節性T細胞、CD8+細胞毒性T細胞、天然免疫殺傷細胞NK細胞，這四種CD分型的淋巴細胞的變化趨勢恰好與胃癌、結直腸癌患者呈相反變化(圖2～5)。

注：與對照組比較，aP<0.01,bP<0.05

表2 腫瘤患者化療前后外周血中NK細胞及Treg比例的變化

討論

人體的免疫系統穩態主要取決于人體對外來抗原的免疫反應以及對自身抗原免疫耐受之間的平衡。而腫瘤細胞本身帶有一些自身抗原，故許多研究者認為機體抗腫瘤反應與自身免疫反應有著共同的基礎。Treg細胞作為腫瘤免疫逃避機制中的一種重要媒介正受到越來越多的關注。它在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織呈現高表達，其可能通過抑制活化的T細胞發揮免疫抑制作用。

相關研究表明，隨著年齡的增長，機體內的Treg細胞會不斷增高[11]，故老年人腫瘤發病率較青年人高，這可能與Treg細胞在腫瘤免疫逃避中發揮的作用相關。而本實驗結果也證實，在惡性腫瘤患者中，CD4+CD25highCD127-Treg及NK細胞比例較正常人對照組明顯增高。而人體固有免疫在抗腫瘤免疫反應中也起著重要作用，化療前后NK細胞未見明顯變化，說明化療并未抑制機體的免疫反應。

本研究由于樣本數量有限，沒有統計得到化療期間患者外周血中的各型淋巴細胞的顯著差異，但是仍然發現到一些我們值得探討的趨勢。隨著化療的進行，Treg和NK細胞，CD8細胞毒性T淋巴細胞之間此消彼長的趨勢，隨著本研究的繼續深入，可能進一步證實Treg細胞在腫瘤中富集，形成免疫抑制微環境，是通過抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞及NK細胞的腫瘤殺傷效應，介導腫瘤免疫逃逸的可能。

根據實驗結果，腫瘤患者Treg比例明顯增高，如果能下調Treg細胞的比例將有助于提高機體抗腫瘤能力。目前已有多種免疫抑制信號相關的阻斷抗體上市(如CTLA-4的抗體Ipilimumab等)故去除腫瘤患者的Treg細胞可能是治療腫瘤的一種有效的新療法。

(本文圖1～5見光盤)

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