α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中苦馬豆素含量

王 帥，吳書奇，陳根元，胡建軍，張 玲，馬春暉

（新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室/塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300）

苦馬豆素（swainsonine，SW）是小花棘豆等瘋草的主要有毒成分，嚴重影響了新疆畜牧業的發展［1-2］。SW有調節動物免疫功能的作用，該作用與SW的濃度密切相關。目前，SW的免疫學研究已成為熱點，因此，動物血清中SW含量的測定顯得極為重要。目前，國內采用的苦馬豆素含量測定方法有薄層色譜掃描法［3］、α-甘露糖苷酶法［4-5］、氣相色譜法［6］和高效液相色譜法［7］。薄層色譜掃描法重現性和精確性都較差；氣相色譜法前處理繁瑣，檢測樣品易受蒸氣壓、溫度等的限制，而且苦馬豆素不易氣化，需進行衍生化處理，其應用也受到限制；高效液相色譜法需要的儀器特殊，溶劑系統選擇也不成熟，需要進一步研究［5-7］。目前，關于α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中SW含量的文獻報道較少。α-甘露糖苷酶活性抑制分析屬于酶分析法（enzymatic assay）。α-甘露糖苷酶可降解甘露糖苷，而SW與α-甘露糖苷酶的結構相似，能競爭性抑制α-甘露糖苷酶的活性，且隨著SW濃度的變化，這種抑制作用的強弱也發生相應變化，可以通過測定甘露糖苷或其分解產物的量間接測定SW的含量。當SW的濃度達到0.5μg/mL以上時就對α-甘露糖苷酶表現出抑制作用，且該抑制作用與溶液pH密切相關［4-5］。本試驗旨在建立快速、準確、靈敏的SW含量測定方法，為測定試驗動物血清、組織、排泄物、胃腸內容物等中SW的含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 小花棘豆樣品于2010年8月采自新疆克州阿合奇縣色帕巴依鄉（40°59′2′′N，78°42′28′′E），采集時正值結實期，標本由塔里木大學動物科學學院草業科學學科組鑒定。

試驗動物：家兔8只，雌雄各半（雌兔的編號為1、3、5、7，雄兔的編號為 2、4、6、8）。體重（2.0±0.1）kg/只，購于塔里木大學動物科學學院試驗基地。每只家兔以10 g/（d·kg）飼喂小花棘豆。試驗開始后每隔7 d采集血液一次，并分離血清，-20℃保存。共采血5次。

試劑：苦馬豆素（SW）標準品，SIGMA；α-甘露糖苷酶、對硝基苯基-α-D-甘露糖苷，美國SUPELCO；其它試劑如氫氧化鈉、檸檬酸等均為國產分析純。

儀器：PowerWave XS型全波長酶標儀，美國；MR231型高速冷凍離心機，法國Jouan；Direct-Q3型超純水系統，美國Millipore；BCD-223GB型冰箱，廣東科龍電器；FA/4A型電子天平，上海精密電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 技術路線 試驗反應器皿為96孔酶標板。向酶標板每孔中依次加入反應緩沖溶液50 μL、0.025 u/mL α-甘露糖苷酶溶液 50 μL、待測樣品液 50 μL，混勻后37℃孵育15 min；然后加入底物（20 mmol/L對硝基苯基-α-D-甘露糖苷溶液）50 μL，混勻后 37℃孵育 90 min；孵育結束后加入反應終止液（pH 9.8的硼酸鈉緩沖溶液）100μL，立即使用酶標儀測吸光度值。測定波長405 nm［5］。

1.2.2 試驗條件的選擇 于酶標板第1行的各孔中加入pH 2.5的反應緩沖溶液50 μL，第2行的其余各孔中加入 pH 3.0 的反應緩沖溶液 50 μL；第 3、4、5、6、7、8 行各加入 pH 值為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 的反應緩沖溶液50 μL；然后第1列和第2列不添加SW標準品溶液，第3列和第4列加入濃度為10-5mol/L的SW標準品溶液50 μL，第5列和第6列加入濃度為10-6mol/L的SW標準品溶液50 μL，依此類推，最后向第11列和12列加入濃度為10-9mol/L的SW標準品溶液50 μL［5］；最后各孔中加入0.025 u/mL α-甘露糖苷酶溶液50 μL，混勻后立即37℃孵育15 min；然后加入底物（20 mmol/L對硝基苯基-α-D-甘露糖苷溶液）50 μL，混勻后37℃孵育90 min；孵育結束后加入反應終止液（pH 9.8的硼酸鈉緩沖溶液）100 μL，立即使用酶標儀測吸光度值。測定波長405 nm。以第1列和第2列的平均值作為100%α-甘露糖苷酶活性，計算不同SW濃度下α-甘露糖苷酶活性變化。篩選吸光度值變化呈線性相關的條件為樣品測定方法。

1.2.3 苦馬豆素標準曲線的繪制 準確配制1.73（10-6mol/L）、0.865（5×10-7mol/L）、0.433（2.5×10-7mol/L）、0.217（1.25×10-7mol/L）、0.109 mg/mL（6.25×10-8mol/L）5 個質量濃度梯度的SW標準溶液。每個濃度梯度做8孔。以SW濃度Y對其吸光度X進行回歸分析。

1.2.4 加標回收試驗 精密量取0.865 mg/mL SW標準溶液50 μL于96孔酶標板中，然后加入50 μL 1.73 mg/mL SW標準溶液，測定吸光度值，共做8孔。

1.2.5 血清樣品的測定 每個血清樣品做8孔，以未采食小花棘豆的正常兔血清作為陰性對照，計算血清中SW含量。

1.3 數據分析 數據采用EXCEL 2007進行處理，用SPSS 11.5中One-Way ANOVA進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的確定 當反應緩沖液的pH值為4.5時不同濃度SW溶液反應光度值變化線性相關度最好。根據圖1所示，隨著SW濃度的升高，α-甘露糖苷酶的活性逐漸降低。當SW的濃度在10-9～10-5mol/L范圍內時，α-甘露糖苷酶的活性呈“S”形；當SW濃度不低于10-8mol/L時，對α-甘露糖苷酶的抑制作用明顯增強；當SW濃度高于10-6mol/L時，α-甘露糖苷酶的活性全部被抑制。根據SW濃度與與其抑制的AMA活性百分比做線性回歸，結果SW濃度在10-8～10-6mol/L時SW濃度與其抑制的α-甘露糖苷酶活性呈線性關系。

2.2 苦馬豆素標準曲線的制作 以SW濃度Y對其吸光度X（見表1）進行回歸分析，得回歸方程：Y=-0.012X+0.034，R2=0.999（圖 2），表明 SW 濃度在 0.109～1.73 mg/mL范圍內線性關系良好。根據8次重復測定的RSD值，α-甘露糖苷酶法測定苦馬豆素含量的精密度較好。

2.3 加標回收試驗結果 待測樣中SW質量0.140 7 mg，理論值0.139 8 mg，平均回收率100.64%，RSD=2.743%。結果見表2。

圖1 SW抑制α-甘露糖苷酶劑量范圍的測定結果

表1 苦馬豆素標準曲線測定結果

圖2 苦馬豆素標準曲線

表2 加標回收試驗結果

2.4 樣品中SW的含量 試驗家兔血清中SW的含量結果見表3。7 d時試驗兔的血清SW含量差異明顯。這可能與兔子的個體差異有關；而且在飼喂小花棘豆的初期，部分試驗兔采食情況不佳，也可能導致血清樣品中SW含量的差異。隨著試驗的進行，同種性別的試驗兔血清SW含量差異趨于不顯著，且雄性試驗兔的數據更為整齊。家兔血清中SW的含量隨著飼喂時間的延長呈現由低到高的趨勢，由此說明α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中SW含量的方法能夠滿足試驗研究。另外，雌性試驗兔血清SW含量一直顯著高于雄性試驗兔，說明雌性家兔較雄性家兔易發生小花棘豆中毒。這與沈明華等［8］報道的雌性家兔甘肅棘豆中毒癥狀的出現時間早于雄性家兔的研究結果一致。

表3 樣品中苦馬豆素含量 mg/L

3 討論

3.1 不同方法測定血清SW含量的比較 目前國內外所采用的方法主要有薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜分析法和酶法測定等。薄層掃描法簡單快捷，易于操作，但用于定量分析時誤差較大［3］。高效液相色譜分析的檢測器檢測的是樣品中的發色基團，需要將苦馬豆素衍生化，而且高效液相色譜分析所需儀器較復雜，成本較高，不利于推廣［5，7］。目前SW定量測定應用最多的是氣相色譜法，該方法具有檢出率高，檢測速度快，可實時監測SW合成過程，適用于精確分析樣品中苦馬豆素含量；但SW不易氣化，高溫下易發生脫水從而導致結構改變，故檢測時需制備易升華且穩定的SW衍生物，而且對血清樣品的前處理極為繁瑣［6］，所以目前SW的氣相色譜分析更多的應用于植物樣品分析中。α-甘露糖苷酶活性抑制分析法多用于血清中SW的定性定量分析［9-10］，由于血液中各種有機物質和無機離子較多，采用色譜法很難分離完全，定量分析就更為困難；而酶分析法不需要對樣品進行分離，也不需要復雜的儀器，簡單而適用，同時可跟蹤分析血清中SW的含量。而且酶分析法靈敏度高，適用于血清、乳制品等樣品中SW含量的微量分析。

3.2 α-甘露糖苷酶法測定SW含量的影響因素 Dorling等［11］研究發現SW在pH 4.0左右時對刀豆屬α-甘露糖苷酶表現出抑制作用。Kim等［12］利用酶分析法繪制出了刀豆屬α-甘露糖苷酶活性與SW濃度變化的標準曲線圖。Scaman等［13］報道了一種簡單且通用的分光光度分析法測定α-甘露糖苷酶的活性，可用于天然底物或人工合成底物。這些為α-甘露糖苷酶活性抑制分析法測定SW含量提供了基礎。Taylor等［4］以此發展了一種定性定量分析血清、乳中SW含量的方法。將樣品置于微孔板中并加入檸檬酸鹽緩沖液和α-甘露糖苷酶于37℃下孵育，以對硝基苯基-α-D-甘露糖苷作為底物，反應完全后，采用分光光度法測定產物的光密度以間接評價樣品中的SW含量。α-甘露糖苷酶活性抑制分析法的靈敏度直接依賴于SW對α-甘露糖苷酶活性抑制程度，如果SW濃度過低，對α-甘露糖苷酶活性抑制作用就不明顯，使用酶分析法就無從談起。本試驗發現當苦馬豆素濃度在10-9～10-6mol/L范圍內，反應pH值為4.5時，α-甘露糖苷酶分析法具有較好的準確性，與孔祥雅等［5］的研究結果較為一致。

4 結論

本試驗采用α-甘露糖苷酶法測定血清中SW的含量。數據表明，α-甘露糖苷酶法具有回收率和準確度高、精密度好、靈敏可靠、操作簡便快速、特異性好等優點，可作為血清SW的微量定量檢測方法。

［1］王帥.新疆小花棘豆中苦馬豆素的提取方法研究［D］.阿拉爾：塔里木大學碩士學位論文，2010.

［2］高木木.新疆棘豆屬植物研究［D］.石河子：石河子大學碩士學位論文，2008.

［3］童德文，曹光榮，耿果霞，等.薄層掃描測定5種瘋草中苦馬豆素含量［J］.中國獸醫學報，2003，23（2）：183-185.

［4］Taylor J B，Strickland J R.Appearance and disappearance of swainsonine in serum and milk of lactating ruminants with nursing young following a single dose exposure to swainsonine（locoweed；Oxytropis sericea）［J］.American Society of Animal Science，2002，80：2476-2484.

［5］孔祥雅，荊心堂，張麗慧，等.苦馬豆素抑制α-甘露糖苷酶的劑量效應關系［J］.動物醫學進展，2011，32（1）：43-46.

［6］宋毓民，王建華，王愛華，等.家兔血清中苦馬豆素的氣相色譜測定方法［J］.中國獸醫學報，2010，30（3）：402-405.

［7］段秋燕，黃新異，柳軍璽，等.HPLC法測定小鼠血漿中苦馬豆素濃度及藥動學研究［J］.藥物分析雜志，2010（4）：25-28.

［8］沈明華，莫重輝，趙寶玉，等.家兔實驗性甘肅棘豆中毒的臨床癥狀和病理形態學觀察［J］.動物醫學進展，2010，31（1）：44-49.

［9］Stegelmeier B L，James L F，Panter K E，et al.Tissue swainsonine clearance in sheep chronically poisoned with locoweed（Oxytropis sericea）［J］.Animal Science，1998，76（4）：1140-1144.

［10］Panter K E，James L F，Stegelmeier B L，et al.Locoweeds：effects on reproduction in livestock［J］.Nat Toxins，1999，8（1）：53-62.

［11］Dorling P R，Huxtable C R，Colegate S M.Inhibition of lysosomalαmannosidase by swainsonine，an indolizidine alkaloid isolated from Swainsona canescens［J］.Biochem J，1980，191：649-651.

［12］Kim Lan Sim，Perry D.Swainsonine production by Metarhizium anisopliae determined by means of an enzymatic assay［J］.Mycological research，1995，99（9）：1078-1082.

［13］Scaman C H，Lipari F，Herscovics A，et al.A spectrophotometric assay for α-mannosidase activity［J］.Glycobiology，1996，6（3）：265-270.