化瘀散結(jié)片對實(shí)驗(yàn)性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變müller細(xì)胞膠原纖維酸性蛋白的影響

吳要華 葉河江 張曉婷 王文麗 盧艷平 嚴(yán)然 鐘振東

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是臨床常見致盲眼病,其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,但大家公認(rèn)PVR的發(fā)病機(jī)制主要是一個(gè)細(xì)胞介導(dǎo)的病理過程[1]。其基本病理過程主要表現(xiàn)為細(xì)胞的增生及增生膜的形成與收縮。其中細(xì)胞包括RPE、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等,以前的研究多集中在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinal pigment epithelial cells,RPE)細(xì)胞,而對另一關(guān)鍵細(xì)胞müller細(xì)胞研究較少涉及。müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[2],在視網(wǎng)膜的整個(gè)功能活動(dòng)和病理生理中起著重要作用[3]。有文獻(xiàn)[4]提到視網(wǎng)膜損傷后早期müller細(xì)胞即出現(xiàn)反應(yīng)性膠質(zhì)化。但müller細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)性改變的分子機(jī)制及信號傳導(dǎo)以及對視網(wǎng)膜功能影響的機(jī)制并不清楚。而膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是müller細(xì)胞的主要構(gòu)成部分。故我們研究兔眼發(fā)生增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變后müller細(xì)胞GFAP表達(dá)的變化,以探討GFAP免疫反應(yīng)變化在müller細(xì)胞反性應(yīng)膠質(zhì)化中的作用,為進(jìn)一步研究müller細(xì)胞在PVR中的作用及機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:青紫藍(lán)兔54只,體重1.5～3.0kg不等,雌雄不限(裂隙燈及檢眼鏡檢查以排除外眼及眼底疾病),許可證:SCXK(川)2008-14,由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)委員會(huì)養(yǎng)殖場提供。化瘀散結(jié)片:由水蛭、三棱、山楂、昆布、海藻等中草藥按現(xiàn)代制劑制備工藝制成,西安碑林藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),臨用時(shí)用三蒸水按照所需濃度進(jìn)行稀釋。使用時(shí)研成粉末,三蒸水混合,配制成混懸液。道諾霉素,意大利生產(chǎn),購自SIGMA公司,批號:010M1117V。臨用前無菌生理鹽水配制成0.05mg/ml溶液。GFAP一抗、S- P免疫組化染色超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組造模、給藥及標(biāo)本采集:54只成年健康青紫藍(lán)兔隨機(jī)分成6組,分別為正常組、陰性對照組、陽性對照組和化瘀散結(jié)片高、中、低劑量組,每組9只兔18只眼。除正常組外,其余5組兔參照朱丹[5]等的方法造成增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型。造模前用氯霉素滴眼液滴雙眼,3次/日共3天。術(shù)前用美多麗眼液散瞳直徑約8mm,鹽酸丙美卡因滴眼液角膜表面麻醉,3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(1ml/kg)全身麻醉。將家兔的四肢固定,頭部置于顯微鏡手術(shù)臺(tái)上。充分暴露眼球。用一空針抽取事先備用的Dispase I液0.05ml于6點(diǎn)鐘角膜緣后3～4 mm處穿透鞏膜,進(jìn)入玻璃體腔,當(dāng)瞳孔區(qū)見到針尖抵達(dá)玻璃體中央時(shí),將針尖斜面向上,緩慢注入,拔針后立即用棉簽壓迫針孔lmin左右以防止反流。術(shù)后雙眼滴氯霉素滴眼液,3次/日共7天。共造模45只兔子。空白對照組9只兔子則向玻璃體腔注0.05ml無菌生理鹽水,操作方法同上。造模后在有增殖條帶出現(xiàn)時(shí)開始給藥,正常對照組、模型對照組玻璃體腔注射無菌生理鹽水0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)連續(xù)灌胃28天,1次/日;陽性對照組玻璃體腔注射道諾霉素溶液(0.05g/ml)0.1ml共一次,三蒸水(5ml/kg)連續(xù)灌胃28天,1次/日;化瘀散結(jié)片高、中、低劑量組分別按1g /5ml /kg、0.5g /5ml /kg、0.25g /5ml /kg的濃度連續(xù)灌胃28天,1次/日。給藥28天后處死動(dòng)物,立即摘除眼球,各組隨機(jī)選取9只眼球,4%多聚甲醛固定一周后取出眼球。

1.2.2觀察指標(biāo)與方法:石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水后,采用S- P免疫組化法檢測視網(wǎng)膜組織GFAP的表達(dá)。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明、封片。陰性對照省去滴加GFAP一抗的步驟。用圖像分析軟件Motic Images Advanced計(jì)算IOD值(積分光密度),測量GFAP表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變后GFAP的表達(dá)免疫組化染色及OD值

正常對照組:兔眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下可見少許狀棕色陽性GFAP著色,其余視網(wǎng)膜各層未見陽性GFAP著色(圖1)。

模型對照組:在內(nèi)界膜、外界膜和色素上皮層均充滿了棕色陽性GFAP著色。視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)模糊不整齊,各層細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞形態(tài)不清。

陽性對照組:在內(nèi)界膜、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)從狀層、內(nèi)核層、外叢狀層可見稀疏的垂直于視網(wǎng)膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外核層。視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)清晰整齊,各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)清晰。

高劑量治療組:在內(nèi)界膜、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)從狀層、內(nèi)核層可見稀疏的垂直于視網(wǎng)膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外叢狀層。視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)清晰整齊,各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)清晰。

中劑量治療組:在內(nèi)界膜、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)從狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層可見稀疏的垂直于視網(wǎng)膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,未延伸到外叢狀層。視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)清晰整齊,各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)清晰。

低劑量治療組:在視網(wǎng)膜各層可見垂直于視網(wǎng)膜長軸分布的線條狀GFAP陽性著色,視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)不甚清晰整齊,各層細(xì)胞排列不整齊,細(xì)胞形態(tài)不清。

圖1 (黑色箭頭表示棕褐色染色×200)

表1 各組GFAPIOD值的變化

注：與空白對照組比較:“△”P<0.05;“△△”P<0.01

與陰性對照組比較:“▲”P<0.05;“▲▲”P<0.01

“★”:陽性對組有一只動(dòng)物的左眼并發(fā)眼內(nèi)炎癥,故未列入觀察

“■”:中劑量治療組一只動(dòng)物在麻醉過程中死亡,一只動(dòng)物的左眼并發(fā)眼內(nèi)炎癥

3 討論

PVR是引起孔源性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗和復(fù)發(fā)的最重要原因,在手術(shù)成功的病例中也可因PVR的存在影響患者視功能[6]。臨床上孔源性視網(wǎng)膜脫離中PVR發(fā)生率約為5%～10%[7,8]。

Müller細(xì)胞是PVR增生膜中的重要成分[9],在PVR發(fā)發(fā)展過程中起著重要作用。有研究[10]提示與以往認(rèn)識(shí)相比,müller細(xì)胞可能在PVR增生膜中發(fā)揮更加積極的作用,特別是在RPE細(xì)胞豐富的環(huán)境中刺激下。GFAP是構(gòu)成膠質(zhì)細(xì)胞支架的主要部分,由于其不與神經(jīng)元及其突起、肌細(xì)胞、肌原纖維、成纖維細(xì)胞等發(fā)生免疫反應(yīng)而有別于波形蛋白(vimentin)和結(jié)蛋白(desmin),常被作為膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物應(yīng)用于免疫研究[11]。GFAP的表達(dá)增加水平,反映了Müller細(xì)胞分化增生的活躍程度。

中醫(yī)學(xué)目前認(rèn)為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變屬于眼科血證中死血、干血的范疇,是眼科血證的晚期病癥,其具體表現(xiàn)為在神膏內(nèi)或視衣上形成有形之物,牽拉視衣,致視衣脫離。死血與干血分別出現(xiàn)于眼科血證的不同時(shí)期。臨床上死血期多見于眼內(nèi)出血后約45天到75天;而干血期則發(fā)生于出血后75天以上。其病機(jī)多為脾虛、腎虛或濕熱等,導(dǎo)致陽氣陰血不能充養(yǎng)于目,一方面視衣失于滋養(yǎng)或固攝;另一方面目失所養(yǎng)使病理產(chǎn)物蓄積(氣滯、瘀血、水積、痰飲等)而成本病,故應(yīng)以活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為其治療大法。而化瘀散結(jié)片具活血化瘀、消積導(dǎo)滯、軟堅(jiān)散結(jié)之功。既往研究表明:化瘀散結(jié)片能提高源于雙極細(xì)胞或müller細(xì)胞的b波波幅,縮短b波峰潛時(shí),從而改善視網(wǎng)膜功能[12];同時(shí)化瘀散結(jié)片能抑制誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)的表達(dá)[13,14],進(jìn)而抑制PVR的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化半定量方法,發(fā)現(xiàn)模型對照組GFAP的IOD高于空白對照組,有極顯著差異(P<0.01),提示造模成功;模型對照組GFAP的IOD值高于陽性對照組,有極顯著差異(P<0.01);模型對照組GFAP的IOD值高于化瘀散結(jié)片高劑量治療組、中劑量治療組,有極顯著差異(P<0.01),與低劑量治療組比較無差異(P>0.05)表明化瘀散結(jié)片能減少GFAP表達(dá)水平,可抑制müller細(xì)胞增殖,減輕對視網(wǎng)膜的過度損傷反應(yīng),從而抑制PVR的進(jìn)一步發(fā)展。

[1] Glaser BM,Cardin A,Biscoe B.Proliferative vitreoretinopathy the mechanism of development of vitreoretinal traction[J].0phthalmology,1997,36(7):97.

[2] Lewis GP,Guerin CJ,Anderson DH,et al.Rapid changes in the expression of glial cell proteins caused by experimental retinal detachment[J].Am J Ophthalmol.1994,118:368-376.

[3] Newman N,Reichenbach A.The müller cell:a functional elememnt of the retina.Trends neurosci,1999;19(8):307-312.

[4] 劉大維,謝伯林周繼紅,李曉炎,朱佩芳,蔣建新,楊志煥.兔眼沖擊傷后視網(wǎng)膜損傷的病理學(xué)變化.創(chuàng)傷外科雜志,2001;3:272-274.

[5] 朱丹,趙明威,黎曉新.Dispase金屬蛋白酶誘導(dǎo)的兔增值性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型[J],眼視光學(xué)雜志,2006,8(1):42-45.

[6] The Retina Society Terminology Committee.The classification of retinal detachment with proliferative vitreoferpathy.Ophthalmology,1983;90(2):121-125.

[7] Nagasaki H,Shinagawa K.Mochizuki M.Risk factors for proliferative vitreoretinopathy.Prog Retin Eye Res,1998;17(1):77-98.

[8] Pastor JC.Proliferative vitreoretinopathy:an overview.Surv Ophthalmol,1998;43(1):3-18.

[9] Vinos SA,Van Niel E,Kim HJ,et al.Simultaneous expression of keratin and glial fibrillary acidic protein by the same cells in epiretinal membranes.Invest Ophthalmol Vis Sci 1992;33(12):3361-3366.

[10] Gisela Velez,Alexa R.Weingarden,Budd A. Tucker,et al.“Retinal Pigment Epithelium and Muller Progenitor Cell Interaction Increase Muller Progenitor Cell Expression of PDGFRα and Ability to Induce Proliferative Vitreoretinopathy in a Rabbit Model,”Stem Cells International,Article ID 106486,2012.

[11] Lazarides E,et al. A chemically regulated use of proteins. Annu Rev Biochem 1982;51:234-237.

[12] 茍立成,雷曉琴,王明芳. 化瘀散結(jié)片對兔增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變閃光視網(wǎng)膜電圖的影響[J],陜西中醫(yī),2002,23(10):950-951.

[13] 黃映紅,王明芳,張耿豪. 化瘀散結(jié)片對對兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變細(xì)胞粘附分子的影響[J],陜西中醫(yī),2007,28(4):497-499.

[14] Devine L,Lightman SL,Greenwood J.Role of LFA-1、VLA-4 and VCAM-1 in lymphocyte migration across retinal pigment epithelial monolayers in vitro.Immunology,1996,83(3):456-462.