葛根素對血管生成抑制作用的研究

陶錚 段俊國 高娜 李強

通過前期芪燈明目膠囊對VEGF轉基因斑馬魚血管生成的影響研究,發現膠囊有效成分之一葛根素具有抑制血管生成的作用,我們利用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖模型和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型進一步試驗,證實了葛根素具有抗血管生成活性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

臍內皮細胞(HUVEC)由齊魯制藥公司藥物研究院提供,第7代;雞胚由濟南滋平種蛋有限公司提供。

試劑:M199培養基及DMEM購自Gibco公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA);二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自上海生物工程有限公司,胎牛血清購自Gibco公司;Matrigel 購自BD公司;其它試劑為國產分析純,生理鹽水。

實驗儀器儀器:Airtech 潔凈工作臺,德國Binder CO2培養箱,美國DYNEX Spectra MR 1SPA-0093型酶標儀,日本 OLMPUS X1倒置顯微鏡,培養皿,96孔板,滅菌手術器械(手術刀,剪刀,鑷子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2實驗方法

(1)觀察多個濃度下葛根素對臍內皮細胞增殖的抑制作用。

實驗步驟:HUVEC用無血清的M199培養液稀釋到1×105個/mL,按96孔板每孔100μl接種于96孔培養板中,每孔加2%成纖維細胞生長因子(bGFG),96孔板放入CO2培養箱24 h。細胞貼壁后去除培養基,實驗組分別加入終濃度為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的含葛根素的M199培養基,溶劑對照組加入含0.1%DMSO的M199培養基;另設空白對照組,只加入M199培養基。每組均設4個復孔,培養24 h后,各孔加入20 μL/孔MTT溶液(5 g/L)繼續培養4 h。棄上清液,加入150 μL DMSO溶解,振蕩混勻。在自動酶標儀上570 nm處檢測吸光度(A)值記錄OD值,統計各組細胞數量并計算各組抑制率。

抑制率的計算方法如下:

(2)觀察多個濃度下葛根素對雞胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

實驗步驟:取7日齡50只雞胚蛋,隨機分組為5組,每組10個,在照卵燈下尋找胚頭中軸側區域,劃定1 cm×1 cm圓形開窗部位,用75%乙醇溶液消毒開窗部位,在雞胚氣室端鉆孔2 mm小孔并穿透殼膜。暴露出雞胚尿囊膜,將明膠海綿放置于尿囊膜上血管部位,用微量進樣器將葛根素配液滴加入甲基纖維素濾膜中,分別為60 μg/個、100 μg/個,160 μg/個加藥完畢后用膠帶密實封口。并繼續放入38℃的孵箱內孵育72 h。

新生血管數量計算:揭開透明膠帶,加滿4%多聚甲醛,4℃下原位固定30 min。待CAM上血管內的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM水平以上的蛋殼,以濾膜載體為中心把CAM剪下,投入水中,使其舒展開,并將其在水中轉移到載玻片上,自然干燥。拍照后用Photoshop選定照片上的一定面積(300×300像素),計算3個面積內的平均血管數目計入統計,并運用Image pro-plus統計血管面積計入統計。

2 實驗結果

2.1內皮細胞的增殖的抑制作用

實驗結果顯示對照組細胞生長良好,溶劑組對細胞生長無影響;用藥組葛根素從10～80 μg·mL-1均顯示出明顯的抑制內皮細胞生長的作用,在20 μg·mL-1就顯示出較佳的抑制率,達到25%抑制率,40 μg·mL-1以上未見劑量依賴性增長。

2.2葛根素對雞胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

實驗結果顯示,對照組微孔濾膜周圍血管CAM血管生成良好,成樹枝狀呈非特異性的貫穿、雜亂、包繞、葉脈樣、平行生長,手術組微孔濾膜周圍CAM血管數目明顯多于對照組,用藥組出現用藥區域無血管區或血管斷裂現象,且血管變細、側枝減少、藥物濾膜遠端血管密度增加等現象,尤其細小血管數目顯著減少。與對照組比較葛根組160 μg·mL-1具有顯著性抑制血管面積的作用,與手術組比較葛根組中高劑量具有顯著性抑制血管面積的作用。

A:對照組.B:葛根素20 μg·mL-1.C:葛根素40 μg·mL-1.D:葛根素80 μg·mL-1.

注:與對照組比較△P<0.01;與手術組比較**P<0.01

3 討論

葛根素(puerarin)是由豆科植物野葛(puerarialobata)甘葛藤(puerarinthomsonii)根中提取的一種黃酮昔。具β腎上腺素受體阻滯作用,可增強心肌收縮力,保護心肌細胞;擴張血管,降低血壓及眼內壓,改善微循環的功效。國內研究發現糖尿病伴血管病變患者靜滴葛根素3個療程后,血漿ET水平降低,N0水平升高,而對照組無此現象[1]。表明葛根素有通過改善血流動力學,糾正神經內分泌系統的失衡及對內皮細胞的保護作用,從而達到防治糖尿病血管并發癥的目的,但具體抑制新生血管的機制有待研究。

A:對照組.B:手術組。C:葛根素60 μg.D:葛根素100 μg.E:葛根素160 μg

葛根素是芪燈明目膠囊有效成分之一,芪燈明目膠囊是針對糖尿病視網膜病變非增殖期的陰虛燥熱,肝腎虧虛和目絡癖滯的基本病機,以益氣養陰,活血通絡之法,結合臨床及中藥的現代研究的成果,優選三味中藥并對其進行了現代工藝的提取,確定以黃酮類物質為主的有效部位群制而成。DR的發生發展與VEGF、FGF、EGF等多種新生血管生長因子有關,VEGF是一種直接反映視網膜新生血管進程的重要的分子信號,在視網膜病變的早期發展中起重要的作用[2]。此次研究發現葛根素在10～80 μg·mL-1范圍內均具有抑制臍內皮細胞增殖的作用,在60～160μg/個范圍內均具有較強的抑制雞胚尿囊膜微血管生成的作用?？梢灾儡螣裘髂磕z囊能夠對糖尿病視網膜病變的發生發展起到一定的預防和治療作用,為接下來重點針對新生血管生長因子信號傳導通路的機制研究提供證據引導。

[1] 杜紅艷.葛根素治療缺血性視神經病變的療效觀察[J].臨床眼科雜志,2003,11(1):77.

[2] 李強,段俊國,王紅義.芪燈明目膠囊對自發性糖尿病大鼠視網膜蛋白激酶C表達的影響[J].眼科新進展,2010,3(3):210-213.