金屬硫蛋白對熱應激奶牛血淋巴細胞凋亡基因和HSP70基因表達的影響

羅佳捷，吳宗明，張彬＊，李麗立，吳力專，陳宇光，肖定福，畢小艷

（1.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所動物生態營養與健康養殖聯合實驗室 農業生態工程重點實驗室，湖南 長沙410125）

熱應激對奶牛生產性能、繁殖性能及免疫性能等方面均有不利影響［1－3］，探索減少或緩解熱應激的途徑一直是奶牛飼養業的重大課題之一。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種低分子量、富含金屬和半胱氨酸的功能性結合蛋白，是遍布于哺乳動物各個組織且具有廣泛而重要生理學和生物學功能的天然生物活性物質［4］。MT的主要作用是參與微量元素儲存、轉運和代謝，重金屬解毒，拮抗電離輻射，清除羥基自由基，增強機體免疫力，提高抗應激和抗氧化能力，參與DNA的復制、轉錄和能量代謝的調節過程，其中尤以清除羥基自由基、抗應激和抗氧化的作用大，其研究和開發涉及農業、醫藥保健、生物工程和環境保護等諸多領域［5－10］。近年來，有關學者初步研究了MT在奶牛體內的代謝規律及其對奶牛抗熱應激調控的機理，發現MT能通過提高奶牛體內超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）基因的表達水平來顯著提高奶牛的抗熱應激和抗氧化能力［11－14］，但此類研究較少，且欠深入。有研究指出，熱休克蛋白HSP70和抗細胞凋亡基因Bcl－2均能有效提高機體對抗熱應激的能力［15，16］，Bax和p53基因則能通過促進機體細胞凋亡來削弱機體抗應激的能力［17－19］，而MT對奶牛體內HSP70和細胞凋亡基因表達的影響尚未見報道。本研究擬探索外源性MT對奶牛體內HSP70、Bcl－2、Bax和p53基因表達的影響，為揭示MT調控奶牛抗熱應激機理的理論研究及其在奶業安全生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料及其來源

金屬硫蛋白使用湖南農業大學畜禽品質改良實驗室建立的方法誘導合成、分離和純化的奶牛肝臟鋅金屬硫蛋白（Zn－MT）［20］，并用該實驗室建立的間接競爭型酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法定量［21］。

1.2 試驗動物的選擇、分組與試驗設計

本試驗于2010年7月27日－8月17日在湖南省畜牧獸醫研究所奶牛場進行，選取年齡、體重、胎次、產犢時間、泌乳量及以往泌乳期產奶成績相近的中國荷斯坦奶牛經產泌乳母牛25頭，隨機均分為A、B、C、D、E 5組，每組5頭。其中A組為對照組，B、C、D、E組為試驗組，分別在正式試驗開始的當天（1d）每頭頸靜脈注射經生理鹽水溶解的Zn－MT 16.0，24.0，32.0和40.0mg。試驗期為15d（1～15d）。

1.3 飼養管理方式

試驗奶牛在同一牛舍以雙列對尾栓系式飼養，每頭牛1個牛床。各組奶牛飼喂相同日糧，日糧系奶牛場參照美國國家研究委員會（national research council，NRC）（2001）和《中國奶牛飼養標準》（2004）自行配制，其組成為（kg／頭）：玉米3.136、麥麩0.728、豆粕0.504、棉粕0.448、菜粕0.280、酵母粉0.280、磷酸氫鈣0.056、石粉0.056、碳酸氫鈉0.056、稻草10、象草20；日糧營養水平：產奶凈能（net energy for lactation，NEL）86.60MJ／（頭·d）、奶牛能量單位（Nainiu Nengliang Danwei，NND）27.60／（頭·d）、粗蛋白質（crude protein，CP）1 585.60 g／（頭·d）、Ca 57.44g／（頭·d）、P 32.80g／（頭·d）。專人飼養管理，各組飼養管理方式一致，每天記錄產奶量。

1.4 采樣

在試驗期的第1（注射MT前），7和14天分別從供試奶牛的尾靜脈采血。每次采血約為20mL，用肝素鈉（3.2mL，250U／mL）抗凝全血，馬上分離淋巴細胞或放入4℃冰箱保存待用。

1.5 基因表達分析

1.5.1 引物設計及合成 基因表達分析采用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法，根據網上（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）發表的基因序列，以Beta－actinmRNA和3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease gene，GAPDH）mRNA 作內參，根據GenBank中奶牛的HSP70、Bcl－2、Bax、p53、GAPDH和Beta－actin的基因登陸序列（依次為 BTU09861、BTU92434、BTU92569、BC102440.1、BTU85042和BC142413），用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5.2 血液淋巴細胞及總RNA的提取 血液淋巴細胞用北京索萊寶科技有限公司生產的淋巴細胞分離液進行提取，所有過程均在無菌操作臺上進行。

表1 HSP70、Bcl－2、Bax、p53、GAPDH 和Beta－actin基因的引物設計Table 1 Primer design for HSP70，Bcl－2，Bax，p53，GAPDHand Beta－actin

1.5.3 反轉錄cDNA 采用 Revert AidTM First Strand cDNA Systhesis Kit反轉錄試劑盒，按試劑盒說明書操作。

1.5.4 cDNA的RT－PCR反應體系HSP70、Bcl－2、Bax和p53的熒光定量RT－PCR反應體系各成分及加樣量見表2。反應條件為：95℃預變性1min，進行如下循環：95℃15s，60℃15s，72℃45s；35個循環后，72℃延伸7min，4℃保存。

1.5.5 RT－PCR產物的檢測與相對定量 所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，條件為：90V，60 min，凝膠電泳成像系統成像，以50bp Marker作對照檢驗目標條帶大小是否與β－actin產物大小相同。本試驗中將cDNA 樣品進行1，5，25，125，625，3 125倍稀釋，對目的基因和內參基因進行PCR擴增，以cDNA稀釋倍數取對數值為橫坐標，△Ct值為縱坐標作圖，得到回歸線y＝0.062 9x＋6.058，R2＝0.55，曲線斜率為0.062 9，說明目的基因和內參基因擴增效率基本一致，可以用2－△△Ct法計算本試驗中基因相對表達量，即以對照組基因表達量為1倍，處理組表達量為相對于對照組的表達倍數。

表2 RT－PCR反應體系各成分及加樣量Table 2 Ingredients and adding－sample amount of RT－PCR reaction system

1.6 數據處理與統計分析

數據用Excel進行初步處理后，再使用SPSS 16.0統計軟件進行成對樣本差異顯著性檢驗，結果用平均值±標準誤表示，檢驗誤差為5%和1%水平。

2 結果與分析

2.1 不同劑量MT對奶牛產奶性能的影響

注射外源性MT后，各試驗組奶牛的產奶性能較A組均有提高（表3），其中B、C組在試驗期第7和14天的產奶量均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于A組；D、E組在試驗期第7天的產奶量雖然較A組有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），而到試驗期第14天時差異均達到顯著（P＜0.05）水平。這說明較低劑量（16.0和24.0mg）的MT在注射后馬上發揮了效用，而較高劑量（32.0和40.0mg）的 MT在注射7d后才開始發揮功效。從各試驗組奶牛在正式試驗期產奶量的平均值看，B、C、D和E組的產奶量比對照組分別高出20.94%（P＜0.05）、15.83%（P＞0.05）、10.94%（P＞0.05）和8.85%（P＞0.05）。說明16.0mg的 MT注射量對熱應激奶牛產奶性能的改善作用最為顯著。

表3 不同劑量MT對奶牛產奶性能的影響Table 3 Effects of MT in different dosages on milk producing ability of dairy cattle kg／d

2.2 不同劑量MT對奶牛HSP70基因表達水平的影響

在正式試驗開始的當天（補給外源性MT前），各組奶牛血液中HSP70基因的表達水平均無顯著（P＞0.05）差異（表4）。補給MT后，4個試驗組奶牛HSP70基因的表達水平均有一定程度的提高，其中C組在試驗期第14天、D組在試驗第7和14天HSP70基因的表達水平均顯著（P＜0.05）高于對照組。就正式試驗期所測奶牛HSP70基因表達水平的平均值看，D組較對照組有顯著（P＜0.05）提高，而B、C、E組雖高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明通過注射32.0mg劑量的外源性MT對奶牛HSP70基因表達量產生了積極的影響。

表4 不同劑量MT對奶牛HSP70基因表達水平的影響Table 4 Effects of MT in different dosages on HSP70gene expression levels of dairy cattle

2.3 不同劑量MT對奶牛Bcl－2基因表達水平的影響

補給外源性MT前，各組奶牛血液淋巴細胞中Bcl－2基因的表達水平差異不顯著（P＞0.05）（表5）。注射MT后，C組在試驗期第7和14天、D組在試驗期第7天及E組在試驗期第14天Bcl－2基因的表達水平均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組；而B組Bcl－2基因的表達水平與對照組差異不顯著（P＞0.05）。從正式試驗期各組奶牛Bcl－2基因表達水平的平均值看，C組顯著（P＜0.05）高于對照組。說明24.0mg劑量的MT對奶牛Bcl－2基因表達的誘導作用最為顯著。

表5 不同劑量MT對奶牛Bcl－2基因表達水平的影響Table 5 Effects of MT in different dosages on Bcl－2gene expression levels of dairy cattle

2.4 不同劑量MT對奶牛Bax基因表達水平的影響

在正式試驗開始時（注射外源性MT前），各組奶牛血液淋巴細胞中Bax基因的表達水平均無顯著（P＞0.05）差異（表6）。注射MT后，B組奶牛在試驗第7天、D組奶牛在試驗期第14天Bax基因的表達水平均顯著（P＜0.05）低于對照組；B、E組奶牛在試驗期第14天及D組奶牛在試驗期第7天Bax基因的表達水平雖然較對照組有所降低，但未達到顯著（P＞0.05）水平；而C組在試驗期第7和14天Bax基因的表達水平比對照組有所提高，但差異也不顯著（P＞0.05）。就正式試驗期各組奶牛Bax基因表達水平的平均值看，盡管B、D兩組Bax基因的表達水平分別較對照組下降了22.00%（P＞0.05）和13.00%（P＞0.05），但各組之間差異均未達到顯著水平。

2.5 不同劑量MT對奶牛p53基因表達水平的影響

在試驗開始時（注射外源性MT前），各組奶牛血液淋巴細胞中p53基因的表達水平均無顯著（P＞0.05）差異（表7）。注射MT后，B組奶牛在試驗期第7天、C組奶牛在試驗期第7和14天、D組奶牛在試驗期第14天及E組奶牛在試驗期第7和14天p53基因的表達水平要顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）低于對照組。就正式試驗期各組奶牛p53基因表達水平的平均值看，C、E兩組分別較對照組下降了22.00%（P＞0.05）和34.00%（P＞0.05）。說明24.0和40.0mg劑量的外源性MT能對奶牛血液淋巴細胞中p53基因的表達產生一定的抑制作用。

表6 不同劑量MT對奶牛Bax基因表達水平的影響Table 6 Effects of MT in different dosages on Baxgene expression levels of dairy cattle

表7 不同劑量MT對奶牛p53基因表達水平的影響Table 7 Effects of MT in different dosages on p53gene expression levels of dairy cattle

3 討論

3.1 MT對奶牛產奶性能的影響

張彬等［11］認為，MT是機體內清除自由基能力最強的一種蛋白質，能夠有效調控奶牛泌乳量和抗氧化能力，及時清除體內自由基，修復細胞氧化損傷。當牛舍的溫濕指數（THI）大于72時，奶牛就處于熱應激狀態［22］，奶牛受熱應激的影響，直腸溫度、呼吸頻率和脈搏等3項生理常數指標均會顯著升高，直接影響到奶牛的采食量，并最終導致產奶量的顯著下降［23］。在本研究中，試驗期間奶牛舍的THI均大于76，說明奶牛一直處于熱應激狀態。對照組奶牛產奶量的逐步減少反應了熱應激對奶牛產生的不利影響，而MT注射組奶牛的產奶量卻有不同程度的提高，4個試驗組全期產奶量的平均值分別比第1天高出4.41%，4.12%，3.70%和0.97%，分別比對照組高出20.94%，15.83%，10.94%和8.85%，說明MT對奶牛熱應激有很好的緩解作用，能有效清除熱應激產生的過量自由基，增強奶牛機體抗氧化功能，進而增加采食量，提高奶牛的產奶性能。此外，吳力專等［5］研究發現，奶牛血清中胰島素（INS）、胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）和甲狀腺素（T3）的含量在注射MT后均顯著升高，說明外源性MT還能通過控制奶牛機體產能來調節體溫，從而提高奶牛的產奶性能。在本研究中，高劑量的MT發揮作用較晚可能是因為機體對高劑量的外源性物質有一定的排斥性，需要一定的時間來接受和適應；MT提高產奶量的效果隨劑量的增加依次降低可能是受到試驗期長度的局限，因為高劑量MT發揮作用較晚，因此在試驗結束時還沒有完全發揮出作用。

3.2 MT對奶牛HSP70基因表達的影響

有研究發現，HSP的合成在細胞應激時會增加，而其他蛋白的合成則減少，并認為HSPmRNA優先翻譯是因為細胞內存在識別HSPmRNA 5′前導區特異結構的系統，可以選擇性地將其翻譯出來［24］；Wang和E－dens［25］通過培養牛、羊、馬和雞的淋巴細胞發現，HSP70和HSP90在熱應激條件下的表達顯著增加。HSP70可以維持細胞內的穩態，以分子伴侶的形式調節其他蛋白質的代謝，HSP70家族在細胞內的高表達或數量的增多可以改善細胞的生存能力，提高熱應激耐受力。當機體受到熱應激時，HSP70的表達水平一般會立即提高，以保護組織細胞免受氧化應激損傷。MT和HSP70作為2種重要的抗應激蛋白，一般在機體內的表達呈明顯的正相關關系，兩者之間相互作用，共同增強細胞對各種損害的耐受程度［26］。本研究中，各試驗組奶牛體內HSP70基因的表達水平在注射MT后均立刻提高，且平均值比對照組分別提高了19.00%，57.00%，130.00%和17.00%，說明外源性MT可能通過抗氧化途徑進一步激活了HSP70基因的表達，從而達到更好緩解奶牛熱應激的目的，且存在明顯的劑量效應。其中，D組的水平明顯好于其他組，表明32.0mg的MT注射量對于提高HSP70基因的表達是最為有利的；而E組的水平與D組相比又陡然下降，這可能是因為E組外源性MT的注射劑量過高，使動物機體由于排斥性等問題不能完全的將其利用，致使其效應反不如注射劑量稍低的D組。

3.3 MT對奶牛Bcl－2、Bax和p53基因表達的影響

本研究之所以探索MT對奶牛血淋巴細胞Bcl－2、Bax和p53基因表達水平的影響，是基于MT及細胞凋亡基因對機體抗熱應激的重要性。Bcl－2是動物機體內重要的抗凋亡基因，能夠有效延長細胞周期［27］；Bax屬于Bcl－2家族，通過與Bcl－2形成二聚體抑制Bcl－2的功能，從而促進細胞凋亡；p53調控一些僅有BH3區域的蛋白，作為Bax的上游調控基因，誘導細胞凋亡的功能十分顯著［28，29］。p53作為促細胞凋亡因子，其高表達能上調Bax的表達和減少Bcl－2的表達，促進細胞凋亡；而Bcl－2又能抑制p53介導的細胞凋亡。當p53基因失活時，引起Bcl－2家族基因調控失衡，凋亡抑制基因Bcl－2的表達水平升高，導致靶細胞不易誘發細胞凋亡［30］，因而p53與Bcl－2家族基因的調控作用是相互聯系的。熱應激能增加HSP的釋放而增加機體免疫力，抑制細胞凋亡，HSP70和HSP90通過與p53形成復合體來阻礙p53進入細胞核，從信號傳導途徑上抑制了細胞凋亡［31］。孫忠東等［32］研究表明，MT的高表達可以抑制心肌細胞凋亡，Bcl－2表達增多同時Bax和Fas表達明顯減少；Shimoda等［33］也曾提出MT是細胞凋亡的抑制劑。本研究中，各劑量的MT均使Bcl－2基因的表達水平明顯升高，基本上與HSP70基因表達水平升高的趨勢相一致，其中24.0mg劑量組達到顯著水平；在Bcl－2基因表達水平升高的同時，Bax和p53基因的表達水平也呈現下降的趨勢，說明外源性MT能通過增加HSP70的表達來抑制p53基因的促凋亡功能。但B組在試驗期第14天和D組在試驗期第7天p53基因的表達呈現出相對較高的水平，B組可能是因為外源性MT劑量不夠，而D組則可能是由于試驗前期MT要大量清除氧化自由基，促進細胞凋亡，加速修復熱應激所致細胞損傷，因而促進了p53基因過表達，試驗后期奶牛應激趨于平穩，細胞應激敏感性降低，為維持機體穩定代謝，抑制細胞凋亡，p53基因的表達水平逐步降低。

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