響應面法優化禿瘡花中生物堿提取工藝及抑菌活性研究

趙強，余四九，王廷璞，袁毅君

（1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州730070；2.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅 天水741001）

禿瘡花（Dicranostigmaleptopodum）又名紅茂草、禿子花、勒馬回，為罌粟科禿瘡花屬草本植物。生于海拔1 300m以上的高原、山坡、丘陵、路旁等處。在甘肅省隴南、天水、平涼等地的渭水流域、秦嶺南北均有廣泛的分布。該植株味苦、澀，性涼，可入藥，有抗炎、抑菌、消腫止痛、清熱解毒等功效［1］。研究表明，由于禿瘡花含有多種異喹啉類生物堿，所以其表現出具有多種生物學活性［2］。將該生物堿臨床用于結核病和竇道潰瘍癥，其總有效率可達90%以上，還具有提高心肌細胞功能、提高機體免疫力、保護受損肝細胞、抗溶血等藥理學活性，且安全無毒副作用［3－6］。

近年來，學者對禿瘡花的研究日漸深入。陳荃等［7］采取石蠟切片法和光學顯微鏡技術，對禿瘡花營養器官進行顯微結構觀察，進一步了解了其微觀結構特點，為該植物的人工馴化和科學栽培提供了基礎依據；趙強等［8］、王廷璞等［9］先后利用指紋識別和波層色譜檢測技術，發現禿瘡花中含有5種主要生物堿成分，其中異紫堇堿含量較高；董曉寧等［10］、趙強等［8］將禿瘡花經石英色譜柱層析的提取物，作用于大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌，發現其具有一定的抑菌效果，其對超氧自由基和羥基自由基也有一定的清除作用；劉大護等［11］利用普通硅膠柱色譜對禿瘡花的生物堿類化學成分進行提取、分離和純化，并利用超導核磁共振等現代光譜和波譜技術鑒定化合物的結構，從禿瘡花中發現11個異喹啉類生物堿，其中2個萘菲啶類、1個嗎啡烷類、4個阿撲菲類和4個普羅托品類生物堿化合物；鞏江等［12］對珍稀中藥禿瘡花進行了藥學研究，發現禿瘡花的生物堿在抗菌、抗腫瘤、肝保護等方面有很強的藥學活性，其具有很好的經濟價值和市場開發前景；趙強等［13］采用酸性染料比色法，以異紫堇堿標準品為對照，對禿瘡花中總生物堿含量進行了測定，從而建立了禿瘡花中總生物堿含量的檢測方法，為該藥材的質量控制和評價提供了科學依據；李巖等［14］利用國際通用DNA條形碼技術，對新疆伊犁地區禿瘡花基因條形碼及系統發生關系進行了初步研究，測序獲得的rbcL和matK基因序列長度分別為539和700bp，用最大簡約法構建了基于rbcL和matK序列的系統樹，發現伊犁禿瘡花聚在罌粟亞科中，與荷青花屬（Hylomecon）、金罌粟屬（Stylophorum）、海罌粟屬（Glaucium）親緣關系較近；朱榮［15］對禿瘡花在Zn、Cd、Cu和Pb脅迫下的耐性和富集特征做了研究，發現其對Cd和Zn具有較強的耐性和富集能力，對Cu和Pb具有較弱的耐性和富集能力。

本試驗于2011年5月開始，采用禿瘡花中的主要生物堿異紫堇堿做為評價指標，通過6組單因素試驗篩選出主要影響因素，再進行響應面法試驗設計，從而優選建立了禿瘡花生物堿最佳提取工藝條件，并將其提取濃縮液作用于3種常見供試菌，研究其體外抑菌活性能力大小，為該植物資源的深層次開發和利用提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 RE52－99型旋轉蒸發儀（亞榮生化儀器廠）、UV－751GD型紫外－可見光分光光度計（瑞利儀器分析有限公司產品）、KQ－500D型數控超聲波清洗器（瑞利儀器分析有限公司產品）、JEM－1230型透射電子顯微鏡（瑞利儀器分析有限公司產品）、AB104－S電子分析天平、索氏提取器等。

1.1.2 藥物及試劑 禿瘡花于2011年4月采自天水師范學院植物園，由王廷璞研究員鑒定。經自然風干、粉碎，過80目篩（0.178mm）。異紫堇堿標準品（美國Sigma化學公司）、磷酸（天津市凱通化學試劑有限公司）、95%乙醇（開封化學試劑總廠）、戊二醛（金山化工廠）等。

1.1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，pH＝7.4。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，瓊脂20g，pH＝7.4。

1.1.4 試驗菌種 大腸埃希氏桿菌（Escherichiacoli，ATCC 12453）、白色念珠菌（Candidaalbicans，ATCC 10231）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa，ATCC 27853）。

1.2 試驗方法

1.2.1 禿瘡花生物堿定性預試驗 稱取禿瘡花干草粉末10.0g，裝入索氏提取器中，水浴加熱回流3h，轉入旋轉蒸發儀中，減壓蒸至無醇味，趁熱加入少許活性炭，封口、靜置、過夜。分別進行碘化鉍鉀、硅鎢酸、苦味酸試驗，均呈明顯的陽性反應，表明樣品中含有生物堿成分。

1.2.2 標準工作曲線的繪制 準確配制0.5mg／mL異紫堇堿標準品溶液100mL，依次量取1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11mL，分別置于100mL容量瓶中，加無離子水稀釋至100mL，搖勻，使之為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55μg／mL的梯度溶液，以三重蒸餾水為空白，選取OD210值進行測定。以濃度C（μg／mL）為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 禿瘡花生物堿的提取工藝 稱取禿瘡花干草粉末7份，每份10.0g。固定液料比14mL／g、浸泡時間18h、回流時間2.5h、超聲時間25min、浸提液pH＝5，考察乙醇濃度為60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%時對提取效果的影響。然后將優選的最佳乙醇濃度做為固定數值，依次選取考察液料比為12∶1，13∶1，14∶1，15∶1，16∶1mL／g，乙醇浸泡時間為0，6，12，18，24，30h，索氏提取器中回流時間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h，超聲波振蕩時間為15，20，25，30，35min，乙醇浸提液pH 值為2，3，4，5，6，7，8時對提取效果的影響。將每次優選后的最佳條件固定，再逐次篩選其余最佳條件。根據單因素水平試驗結果，進行極差分析，最終優選出4個主要影響因素，按照響應面試驗設計方案進行生物堿提取。再將提取液轉入旋轉蒸發儀，35℃下減壓蒸至無醇味，轉入100mL錐形瓶，封口靜置。

1.2.4 禿瘡花生物堿含量的測定 將25個50mL容量瓶中的提取液稀釋后測定其吸光值，對照標準曲線，得出提取液中生物堿的濃度，最后計算出禿瘡花中生物堿提取得率。

1.2.5 響應面法對禿瘡花中生物堿提取條件的優化 在單因素試驗的基礎上，使用Box－Behnken中心設計，通過響應面法進行禿瘡花中生物堿提取條件的優化。

1.2.6 體外抑菌 1）菌液制備：將所選供試菌事先接種于無菌平板上，37℃培養1d后，選取典型菌落，轉移接種在液體培養基中，經37℃培養1d后，再用無菌生理鹽水稀釋，使其為菌量106～107CFU／mL的菌懸液，備用。2）培養基的配制：按培養基配方比例依次準確稱取牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g放入燒杯中，加入蒸餾水1 000mL，調pH＝7.4，即得牛肉膏蛋白胨液體培養基1 000mL，同法另加瓊脂20g，即為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基1 000mL。將配制好的培養基及若干包裝好的試管、燒杯、涂布棒、移液管及若干培養皿于高壓滅菌鍋中，120℃下濕熱滅菌30min，置于37℃培養箱中備用。

3）最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定：將禿瘡花提取濃縮液用無菌蒸餾水倍比稀釋，制備所需系列濃度的稀釋液。然后將稀釋液分別定量轉移至無菌培養皿中，與定量倒入的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基充分混勻，室溫冷卻、凝固，制成含藥液的平板［16－19］。再按培養皿所需的劑量，分別移取定量被試菌液，涂于平板上，置于恒溫箱中37℃培養1～2d，檢查菌落生長情況，以平板菌落計數法計算菌落數，另取各含藥液1∶5濃度無菌陰性和無藥陽性作為對照。以肉眼計數，完全沒有菌落生長時的最低生物堿濃度，為該藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）［16－19］。取上述MIC及以上各濃度未見細菌生長的各試管培養物，分別移取0.1mL接種至不含生物堿的培養基上，涂勻平板，置于恒溫箱37℃培養1d，查看有無菌落生長，計數少于5個菌落者，為該藥物的最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）。以上試驗均重復3次。

4）透射電子顯微鏡觀察：選取典型供試菌（大腸埃希氏桿菌）作為研究對象，將其接種在已制得的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，恒溫箱37℃培養1d后，用pH＝6.0的5mmol／L磷酸緩沖液洗脫細菌，使其含量保持在108CFU／mL左右。移取500μL菌懸液，加到濃度為0.2%的禿瘡花提取濃縮液中（溶于1% 醋酸），使禿瘡花提取濃縮液最終濃度稀釋為0.1%。將其置于1.5mL離心管中，37℃搖床（120r／min）培養1d，離心后取出細菌沉渣。將離心后的細菌團，加3%戊二醛，在4℃時固定5h，用5mol／L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10min，再用1%的OsO44℃后固定1h，最后用5mol／L磷酸鹽緩沖液漂洗3次。使用40%，60%，80%，100%乙醇，4℃下脫水10min，再用純丙酮脫水2次，每次10min。加入環氧樹脂Epon－812（1∶1）與純丙酮，室溫靜置3h，用環氧樹脂Epon－812包埋后，分別在30，40，60℃下，聚合4，12，24h，制成超薄切片，使用枸椽酸鉛和醋酸雙氧鈾雙染色，在JEM－1230型透射電鏡下觀察其抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 禿瘡花生物堿含量的測定

根據異紫堇堿標準品系列濃度梯度在OD210的吸光值，得回歸方程：y＝0.011 0x＋0.065 2，R2＝0.998 9（n＝11），其標準曲線見圖1所示，在5～55 μg／mL內呈良好的線性關系。

圖1 異紫堇堿標準曲線Fig.1 The standard curve of isocorydine

2.2 禿瘡花生物堿單因素提取試驗

2.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響 隨著乙醇濃度的變化，在65%時生物堿含量最大；隨著乙醇濃度的增大，生物堿含量依次呈明顯下降趨勢，此時乙醇濃度對提取效果的影響變得不顯著（圖2）。主要是因為乙醇濃度較大時，會將樣品中的油脂和糖類等物質提取出來，不利于生物堿的提取；乙醇濃度較小時，生物堿在其中的溶解度也較小。故選取適宜生物堿提取的乙醇濃度為65%。

2.2.2 液料比對提取效果的影響 隨著液料比的增加，生物堿的含量也隨之增大；當液料比為15∶1時生物堿含量達到最大值（圖3），其后開始呈下降趨勢，主要是因為在一定范圍內溶劑用量的增加，有助于生物堿的浸出。故選取適宜生物堿提取的液料比為15∶1。

2.2.3 浸泡時間對提取效果的影響 65%乙醇浸泡時間在6～10h時，生物堿含量達到最大峰值（圖4）；當浸泡時間超過12h后，隨著浸泡時間的延長，生物堿含量迅速降低。浸泡時間過長，會使其他化合物溶出，不利于生物堿的提取，長時間浸泡也使得提取周期變長，不利于提取工藝模式的建立。故選取適宜生物堿提取的浸泡時間為8h。

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction effect

圖3 液料比對提取效果的影響Fig.3 The effect of liquid to solid ratio on the extraction effect

2.2.4 回流時間對提取效果的影響 當在索氏提取器中回流時間為2.5h時，生物堿含量呈明顯單一峰值（圖5），此時再進行提取，會發現索氏提取器中的溶液顏色逐漸變淺，說明被提取物已經大部分被提取。故選取適宜生物堿提取的回流時間為2.5h。

2.2.5 超聲時間對提取效果的影響 超聲波振蕩時間在15～30min時，生物堿含量隨時間的增加而增大，并達到最大峰值（圖6）；當時間超過30min后，生物堿含量隨時間增加而減小。使用超聲波可以破碎細胞，加快細胞內物質的溶解，但是超聲作用時間過長，又可以使部分生物堿分解。故選取適宜生物堿提取的超聲時間為30min。

2.2.6 浸提液pH值對提取效果的影響 乙醇浸提液pH值在3～6時，生物堿含量隨pH值的增加而增大，并達到最大峰值（圖7）；當pH值超過6以后，生物堿含量隨pH值增加而減小。這是因為禿瘡花生物堿本身堿性較弱，在弱酸性介質中反應變為鹽類，能使之較好的溶解。故選取適宜生物堿提取的浸提液pH＝6。

2.3 響應面法優化禿瘡花中生物堿的提取條件

2.3.1 響應面試驗因素水平的選擇 采用極差分析對6組單因素水平進行篩選，最終選用液料比、超聲時間、回流時間和乙醇濃度為主要考察因素，進行響應面試驗，使用Design－Expert 7.0軟件，以禿瘡花主要生物堿（異紫堇堿）含量為指標，設計4因素3水平（共29個試驗點，5個中心點）的響應面試驗，每組試驗重復3次，取其平均值，其因素水平如表1所示［20，21］。

圖4 浸泡時間對提取效果的影響Fig.4 The effect of macerating time on the extraction effect

圖5 回流作用時間對提取效果的影響Fig.5 The effect of reflux time on the extraction effect

2.3.2 響應面試驗方案設計及結果分析 以A（液料比）、B（超聲時間）、C（回流時間）、D（乙醇濃度）為自變量，禿瘡花生物堿含量為響應值（Y），進行響應面分析試驗，共有29個試驗，其中24個為析因試驗，5個為中心試驗，用以估計誤差。29組響應面試驗結果，見表2所示。對4個自變量模型，單獨存在及交互作用下的方差分析結果，見表3所示。

通過對試驗結果進行響應面軟件分析，經二次回歸擬合后，得到4個因素與禿瘡花生物堿含量之間的模擬方程為：

Y＝11.338 0＋0.206 6A＋0.763 3B＋0.013 1C＋0.674 2D＋0.177 6AB－0.009 5AC－0.017 0AD＋0.720 7BC＋0.243 9BD＋0.057 1CD－1.007 6A2－1.236 0B2－0.511 8C2－1.343 4D2。

該回歸模型F檢驗為極顯著（P＜0.01），其失擬項在α＝0.05水平上為極顯著（P＜0.01），純誤差項不顯著，其決定系數r2＝0.874 3，說明該擬合方程與實際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應值之間的關系，其影響不是呈簡單的線性關系。通過該方程發現，各種因素之間存在著一定的交互作用，其中B、D、BC、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），A呈顯著影響（P＜0.05），C、AB、AC、AD、BD、CD均呈不顯著。

從單因素水平觀察，可以得出其影響順序為：B（超聲時間）＞D（乙醇濃度）＞A（液料比）＞C（回流時間）。在有交互作用存在下，對禿瘡花生物堿含量的影響順序為：BC＞BD＞AB＞CD＞AD＞AC。

2.3.3 響應面分析 從各因素之間兩兩相互作用的響應面圖形觀察，發現其中曲線走勢越陡，其影響越顯著（圖8）；曲線走勢越平滑，其影響越小。超聲時間、乙醇濃度和液料比的圖形曲線走勢較陡，說明其影響最為顯著。由Design－Expert 7.0軟件進行系統分析，得出影響禿瘡花中生物堿含量的最佳提取工藝條件為：液料比15.14 mL／g、超聲時間34.49min、回流時間2.67h、乙醇濃度66.49%、生物堿含量為11.62%，結合實際操作過程中的局限性，最終確定修正后的工藝條件為：液料比15mL／g、超聲時間35min、回流時間2.5h、乙醇濃度65%，在此工藝下禿瘡花生物堿含量為9.33%。按照優化條件進行平行3組提取試驗，取平均值為9.06%，與理論值相差0.22%，說明采用響應面法優化的提取條件可靠。

圖6 超聲時間對提取效果的影響Fig.6 The effect of ultrasonic time on the extraction effect

圖7 浸提液pH值對提取效果的影響Fig.7 The effect of pH of extracts on the extraction effect

表1 響應面試驗因素水平Table 1 The response surface of level of factor

2.4 抑菌試驗

按照響應面法優選的最佳組合提取禿瘡花生物堿，并減壓濃縮至無醇味，用無菌蒸餾水將濃縮液稀釋為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40mg／mL 8組濃度梯度，另作陽性和陰性對照進行測定，結果表明（表4），禿瘡花提取濃縮液對大腸埃希氏桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌3種供試菌的最小抑菌濃度分別為0.20，0.15和0.35mg／mL，最低殺菌濃度分別為0.15，0.10和0.30mg／mL。

表2 響應面試驗結果Table 2 The experiment result of response surface

表3 響應面試驗方差分析Table 3 The variance analysis of response surface

圖8 各因素之間的等高線圖和響應面圖Fig.8 The contour map and response surface graph between the various factors

表4 禿瘡花提取濃縮液最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定Table 4 The concentrated liquid of the minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration extract from D.leptopodum 個No.

加入禿瘡花提取濃縮液前后，對照組（圖9A）的大腸埃希氏桿菌胞質均勻、細胞膜和細胞壁均完整，其切面呈明顯桿狀。加入禿瘡花提取濃縮液后的大腸埃希氏桿菌（圖9B），細菌外形已變為球形或不規則型，細胞壁變薄且不完整，有些菌體細胞壁部分脫落或消失，細胞壁外觀呈毛刺狀或輪廓模糊，結構不清晰且伴隨不同程度的凹陷變形，細胞外有溶出物溢出。

圖9 禿瘡花提取濃縮液加入前后大腸埃希氏桿菌透射電鏡圖（×50 000）Fig.9 The transmission electron microscopy images of E.coli pretreatment treated with concentrated liquid of extract from D.leptopodum （×50 000）

3 討論

使用響應面法試驗設計，克服了正交設計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷，并能減少試驗次數，分析幾種因素間的交互作用，以達到較全面地反映各因素水平的效果［20－23］。本試驗首先考察了液料比、浸泡時間、回流時間、超聲時間、浸提液pH、乙醇濃度6組單因素水平對禿瘡花生物堿的影響，最終篩出4組主要因素進行響應面試驗設計，確定其最佳提取工藝條件為：液料比15mL／g、超聲時間35min、回流時間2.5h、乙醇濃度65%，在此條件下禿瘡花中生物堿含量為9.33%。

將禿瘡花按照響應面法試驗設計的最佳工藝進行提取，用其濃縮液對大腸埃希氏桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌進行抑菌試驗，發現對這3種供試菌的最小抑菌濃度分別為0.20，0.15和0.35mg／mL，最低殺菌濃度分別為0.15，0.10和0.30mg／mL。以大腸埃希氏桿菌為研究對象，進行50 000倍透射電鏡觀察，其抑菌效果顯著。

禿瘡花在甘肅省隴東南地區資源豐富，有解毒、清熱之功效。通過對禿瘡花中生物堿的響應面提取工藝及抑菌活性研究，為其資源的進一步深層次開發提供了基礎。

［1］江蘇醫學院.中藥大辭典［M］.1版.上海：上海人民出版社，1977：1135.

［2］暢行若，王宏新，馬廣恩.禿瘡花化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，1981，2：52.

［3］趙祁，韓寅，杜宇平，等.禿瘡花提取物對紅細胞氧化性溶血的抑制機制［J］.蘭州大學學報（醫學版），2006，32（3）：41.

［4］Manske R H F，Rodrigo R G A，Holmes H L，etal.The Alkaloids Chemistry And Physiology［M］.1nd ed.New York：Academic Press，1981：191.

［5］張興旺，何莉莉，王勤.紅茂草注射液對免疫低下小鼠免疫功能的影響［J］.蘭州大學學報（自然科學版），2006，42（6）：55－57.

［6］趙強.紅茂草生物堿有效成分分析及抑菌活性研究［D］.蘭州：甘肅農業大學，2009：13－16.

［7］陳荃，鄒亞麗，趙蘭蘭.紅茂草營養器官的顯微結構觀察［J］.天水師范學院學報，2010，30（5）：39－43.

［8］趙強，王廷璞，廖天錄.紅茂草生物堿TLC檢測技術的建立及抑菌活性研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2010，（6）：47－51.

［9］王廷璞，安建平，賈志國，等.紅茂草生物堿提取方法及指紋檢測技術建立的研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2008，（6）：41－44.

［10］董曉寧，趙強，楊明.禿瘡花生物堿的提取與體外抑菌研究［J］.中獸醫學雜志，2010，（2）：6－11.

［11］劉大護，張天才，柳軍璽，等.禿瘡花生物堿類化學成分研究［J］.中草藥，2011，42（8）：1505－1508.

［12］鞏江，駱蓉芳，倪士峰，等.珍稀中藥禿瘡花屬植物藥學研究概況［J］.西北藥學雜志，2010，25（2）：153－154.

［13］趙強，王廷璞，董曉寧，等.酸性染料比色法測定紅茂草中總生物堿含量［J］.中獸醫醫藥雜志，2011，（6）：38－40.

［14］李巖，梁雪，劉斌.伊犁禿瘡花基因條形碼及系統發生關系研究［A］.2011年全國系統與進化植物學暨第十屆青年學術研討會論文集［C］.昆明：云南大學出版社，2011：139.

［15］朱榮.禿瘡花在Zn、Cd、Cu和Pb脅迫下的耐性和富集特征研究［D］.成都：四川農業大學，2011：5－7.

［16］董曉寧，趙強，楊明.苦蕎麥中蘆丁的提取及體外抑菌研究［J］.中獸醫醫藥雜志，2010，（1）：20－21.

［17］趙強，王廷璞，余四九，等.紅茂草生物堿抑菌活性測定［J］.中國獸醫科學，2008，38（12）：1098－1101.

［18］張芳，王舟，宗俊勤，等.農桿菌介導的假儉草遺傳轉化體系的建立［J］.草業學報，2011，20（2）：186－194.

［19］李振東，陳秀蓉，楊成德.珠芽蓼內生菌Z17抑菌能力測定及其鑒定［J］.草業科學，2011，（12）：32－37.

［20］海洪，汪坤，金文英，等.Box－Behnken響應面法優化超聲波提取蠶沙中葉綠素的工藝研究［J］.食品工業技，2009，30（3）：207－211.

［21］王新雯，海洪，金文英，等.微波－超聲波聯合提取銀杏葉黃酮工藝的響應面法分析［J］.食品科技，2010，35（3）：189－193.

［22］何慶元，吳萍，張曉紅，等.不同秋眠性苜蓿SRAP體系優化及遺傳多樣性分析［J］.草業學報，2011，20（2）：203－211.

［23］胡甦，王永清，陶煉.三角紫葉酢漿草ISSR反應體系的建立與優化［J］.草業學報，2011，20（5）：145－153.