冷誘導轉錄因子AtCBF1轉化紫花苜蓿的研究

徐春波，王勇，趙海霞，米福貴＊

（1.內蒙古農業大學生態環境學院，內蒙古 呼和浩特010018；2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特010010）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）簡稱苜蓿，是全世界栽培歷史最悠久、面積最大、利用最廣泛的一種豆科多年生優質牧草。它具有蛋白質含量高、草質好、營養豐富等特點，還具有固氮、保持水土等作用，故又將其稱之為“牧草之王”［1－3］。近年來，隨著我國草地畜牧業的發展和農業產業結構的調整，草產業呈現出強勁的發展勢頭。苜蓿作為草產業發展的主導草種，它在北方高緯度、冬季嚴寒、倒春寒常出現等地區的安全越冬問題，一直是制約上述地區草產業健康發展的突出問題。因此，如何在短時間內培育出適合我國北方高緯度等地區種植的抗寒高產苜蓿新品種，便成為一個急待解決的問題。轉基因技術的快速發展和在苜蓿育種中的應用［4－6］，為快速選育抗寒高產苜蓿品種提供了新的研究手段。

CBF1轉錄激活因子是一類受低溫特異誘導的反式作用因子［7－9］。它能與CRT／DREDNA［C－repeat／dehydration－responsive element（DRE）DNA binding protein］調控元件特異結合，促進啟動子中含有這一調控元件的多個冷誘導和脫水誘導基因的表達，從而激活植物體內的多種耐逆機制［10］。目前已經在油菜（Brassicanapus）、番茄（Lycopersiconesculentum）、煙草（Nicotianatabacum）、多年生黑麥草（Loliumperenne）和黃瓜（Cucumissativus）等［11－20］植物中得到了應用。金建鳳等［21］、吳關庭等［22］和林秀鋒等［23］均利用農桿菌介導法成功地將抗凍轉錄激活因子基因CBF1轉入水稻（Oryzasativa），并獲得了T1代轉基因植株。金建鳳等［21］的研究結果表明，T1代植株體內的脯氨酸含量均比野生型明顯提高，同時，耐低溫表型也在T1－1株系中出現。吳關庭等［22］和林秀鋒等［23］對T1代進行低溫試驗表明，轉基因株系的葉片相對電導率顯著或極顯著低于對照，轉基因植株比對照的抗寒能力提高。袁維風等［24］和金萬梅等［25］利用根癌農桿菌介導法將CBF1基因導入草莓（Fragariaananassa）的不同品種中，采用電解質滲漏法對轉基因株系進行抗寒生理鑒定結果顯示，轉基因株系的電導率普遍低于對照。金萬梅等［25］采用生長恢復法抗寒鑒定結果表明，將轉基因株系和對照于－2～0℃放置7d，在轉基因株系83中有65%的植株出現了萎蔫，而對照植株有91%出現了萎蔫，經22～25℃下進行恢復生長，轉基因株系83有74%完全恢復，而對照株系只有18%恢復，轉基因草莓的抗寒能力較未轉化植株有明顯提高，且不同轉基因株系之間提高程度有差異。王渭霞等［26］將來源于擬南芥（Arabidopsisthaliana）的CBF1基因通過農桿菌法導入松南結縷草（Zoysiasp.）植株中，PCR驗證后187株表現為陽性。陽性植株移栽成活后，離體葉片抗巴龍霉素檢測表明187株均表現出抗性。

本實驗以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR（聚合酶鏈式反應，polymerase chain reaction）法克隆得到了冷誘導轉錄因子AtCBF1基因，在此基礎上成功構建了含有此基因的植物表達載體pBI121－CBF1，并采用根癌農桿菌介導法對紫花苜蓿進行了遺傳轉化，經PCR和RT－PCR（反轉錄RCR，reverse transcription PCR）檢測，得到了650bp左右的電泳條帶，表明AtCBF1基因已在紫花苜蓿中得到表達。這為選育紫花苜蓿抗寒新品種奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥為哥倫比亞生態型，由北京市農林科學院北京農業生物技術研究中心提供；紫花苜蓿品種為“Hunter－river”，由中國農業科學院草原研究所提供。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α、農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株 C58、質粒pBI121由北京市農林科學院北京農業生物技術研究中心園林實驗室保存；載體pGEM－Tvector（簡稱T載體）購自上海生物工程有限公司。

1.1.3 供試試劑 實驗中所用的各種限制性內切酶、RNaseA、Taq酶、dNTP、T4連接酶等購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒、T載體連接試劑盒等購自Promega公司；Marker購自TaKaRa公司；其他化學試劑均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據NCBI GenBank已報道CBF1基因的DNA序列，應用DNAMAN軟件設計引物（CBF1－BamHI－5′端：5′－TCTGGGATCCATGAACTCATTTTCAG－3′；CBF1－Sac1－3′端：5′－TCTGGAGCTCTTAGTAACTCCAAAGCG－3′），由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.2.2AtCBF1基因的克隆 以擬南芥基因組DNA為模板，用設計好的引物進行PCR擴增，反應體系20μL，反應條件：95℃預變性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環，72℃延伸10min；18℃反應結束。PCR產物連接T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態，在含有IPTG（異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷，isopropylβ－D－1－thiogalactopyranoside）和 X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D 半乳糖苷，5－bromo－4－chloro－3－indolylβ－D－galactopyranoside）的LB＋Amp（細菌培養，Luria－Bertani＋氨芐青霉素，ampicillin）固體平板上篩選白色菌落，對重組子TCBF1進行PCR和酶切檢測鑒定后，送交北京奧科生物技術有限責任公司進行測序驗證。

1.2.3 植物表達載體pBI121－CBF1的構建 將質粒pBI121和質粒T－CBF1同時用BamHI和SacI雙酶切后，回收載體片段和AtCBF1基因片段，將2個片段用T4DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有Kan抗性的LB培養基平板上篩選陽性菌落，挑單菌落進行菌液PCR，經PCR鑒定和酶切鑒定，構建成植物表達載體pBI121－CBF1。

1.2.4 植物表達載體pBI121－CBF1的農桿菌轉化 通過電擊法將植物表達載體pBI121－CBF1轉化入感受態農桿菌C58中，在直徑9cm的篩選培養基［LB＋25mg／L Rif（氯福平，rifampicin）＋100mg／L Kan（卡那霉素，kanamycin）＋5mg／L Tet（四環素，tetracycline）］獲得轉化菌落，用PCR法對轉化菌落進行鑒定。

1.2.5 紫花苜蓿遺傳轉化及抗性篩選 將紫花苜蓿種子用70%的酒精和20%的次氯酸鈉分別處理1和15min后接種到無菌苗培養基1／2MS上培養。切取7d齡無菌苗下胚軸，在愈傷誘導培養基［改良SH＋4.0mg／L 2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸鈉，2，4－dichlorophenoxyacetic acid）＋0.5mg／L 6－BA（6－芐基嘌呤，6－benzylaminopurine）］預培養3d，在活化的農桿菌（含CBF1基因）菌液中侵染10min，置于愈傷誘導培養基上共培養3d，經過愈傷誘導篩選培養［改良SH＋4.0mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA＋350mg／L Cef（頭孢霉素，cefotaxime）＋60 mg／L Kan］、繼代篩選培養［MSO＋0.5mg／L NAA（萘乙酸，naphthalene－acetic acid）＋1.0mg／L 6－BA＋1.0 mg／L AgNO3＋350mg／L Cef＋60mg／L Kan］、分化篩選培養（MS＋350mg／L Cef＋20mg／L Kan）和生根篩選培養（1／2MS＋350mg／L Cef＋20mg／L Kan）后得到紫花苜蓿抗性轉化植株。

1.2.6 轉化植株的PCR和RT－PCR鑒定 轉化植株PCR檢測：用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨法，hexade－cyltrimethy ammonium bromide）法提取轉化植株DNA，以未經轉化植株作為陰性對照進行PCR檢測。反應體系25μL，反應條件同AtCBF1基因克隆時的條件。

轉化植株RT－PCR檢測：按照RNA提取試劑盒的操作方法提取轉化植株總RNA，根據RT－PCR試劑盒所提供的操作方法進行反轉錄及PCR反應。

2 結果與分析

2.1 AtCBF1基因克隆的鑒定及序列分析

以擬南芥DNA為模板進行PCR擴增，得到650bp左右的DNA片段（圖1），與預期結果相符。將其連接到T載體上得到重組質粒T－CBF1，對其進一步進行酶切鑒定后，得到3 000和650bp左右的2條DNA片段（圖2），與預期結果一致。將其送交北京奧科生物技術有限責任公司進行測序驗證。測序結果表明所克隆的DNA片段長度為642bp，將該序列與GenBank上的CBF1基因序列進行DANMAN序列比較分析，同源性可達99.84%（圖3），核苷酸比較結果表明本實驗通過PCR克隆的AtCBF1片段確為擬南芥的CBF1基因，具有正常的生理功能，可用于下一步遺傳轉化研究。

圖1 AtCBF1基因片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of AtCBF1gene fragment

圖2 T－CBF1酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of T－CBF1

圖3 AtCBF1基因序列比對圖（同源性99.84%）Fig.3 Sequence alignment of CBF1（identity＝99.84%）

2.2 植物表達載體pBI121－CBF1的鑒定

構建的pBI121－CBF1植物表達載體圖譜（圖4），增加了1個BamHI位點和1個SacI酶切位點，根據載體上這2種酶的酶切位點的特點，用BamHI和SacI進行雙酶切鑒定，得到2個片段，一個為AtCBF1基因，大約為650 bp，另一個為載體，約為12.9kb。從電泳檢測的結果來看（圖5），所構建的pBI121－CBF1表達載體正確。

圖4 植物表達載體pBI121－CBF1質粒圖譜Fig.4 Plasmid map of plant transformation vector pBI121－CBF1

2.3 農桿菌的轉化

采用電擊法將構建好的載體pBI121－CBF1轉入農桿菌菌株C58，隨機挑取6個轉化菌落進行PCR鑒定，結果顯示6個轉化菌落均擴增出650bp左右的特異性條帶，說明表達載體pBI121－CBF1成功轉化農桿菌C58中（圖6）。

圖5 pBI121－CBF1酶切鑒定Fig.5 Restriction enzyme digestion of pBI121－CBF1

圖6 pBI121－CBF1導入農桿菌的PCR檢測Fig.6 PCR analysis of pBI121－CBF1transferred Agrobacterium

2.4 紫花苜蓿抗性轉化植株的獲得

將紫花苜蓿的下胚軸經過預培養3d后，用農桿菌侵染10min，置于愈傷誘導培養基上共培養3d后，轉入愈傷誘導篩選培養基中，在經過繼代篩選培養后轉入分化篩選培養基中，待分化出3～5cm的小苗時轉入生根篩選培養基，最終獲得抗Kan的紫花苜蓿轉化植株（圖7）。

2.5 轉化植株的PCR鑒定

提取轉化植株的基因組DNA，以質粒pBI121－CBF1做陽性對照，以非轉基因植株作為陰性對照，進行PCR擴增。結果表明，部分轉化植株擴增出了與陽性對照相同的大小為650bp左右的特異帶，而陰性對照的泳道上沒有該特征帶，表明目的基因CBF1已經整合到“Hunter－river”紫花苜蓿基因組中（圖8）。

2.6 轉化植株的RT－PCR鑒定

為了檢測CBF1基因在苜蓿轉化植株中mRNA水平上的表達情況，提取轉化植株總RNA（圖9），進行了RT－PCR檢測。結果顯示（圖10），在PCR結果呈陽性的轉化植株中，RT－PCR結果并不全呈陽性，說明PCR有假陽性的存在，同時也表明外源基因CBF1在部分苜蓿轉化植株的轉錄水平上表達。

3 討論

3.1 AtCBF1基因的克隆

植物的耐逆性屬于復雜的數量性狀，是多種耐逆機制共同作用的結果。用單一的功能基因轉化植物，雖能使轉基因后代的耐冷性、耐旱性或耐鹽性得到提高，但效果并不十分理想。CBF轉錄激活因子的發現則為基因工程改良植物耐逆性提供了一種全新的技術途徑［27］。本實驗以擬南芥DNA為模板，用篩選出的CBF1特異引物進行PCR擴增，得到了約650bp DNA片段，通過PCR和酶切鑒定后進行DNA測序，結果表明DNA片段實際大小為642bp，與GenBank中基因序列進行比對，同源性達99.84%，只是在460bp的堿基A置換成T，2個堿基的置換導致了一處氨基酸的差異，但這一氨基酸并不在基因的功能結構域上，推測其不會影響基因功能，可用于下一步的實驗。

圖7 轉化再生植株流程圖Fig.7 Obtaining of the transformed plants

圖8 轉化植株的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of transformed plants

圖9 轉化植株總RNAFig.9 Total RNA of transformed plants

3.2 表達載體的構建

構建含有目的基因的高效植物表達載體，是進行植物遺傳轉化的一個重要前提。本實驗構建成功了由組成型啟動子CaMV35s調控冷誘導轉錄因子AtCBF1基因的植物表達載體pBI121－CBF1，并將其轉入農桿菌C58中，為進一步進行紫花苜蓿農桿菌遺傳轉化奠定基礎。在載體的構建中，現普遍用的是35S啟動子，它能使外源基因在植物的各個部位都表達，特異性較差，且大多數基因都存在功能定位，外源基因在植物體內表達會產生許多沒有功能的蛋白質，可能會影響植物的正常生理代謝，下一步擬構建用AtCBF1特異性啟動子替換CaMV35s啟動子的植物表達載體，便于更好地發揮AtCBF1基因的功能，更加有利于紫花苜蓿的遺傳轉化。

圖10 轉化植株的RT－PCR鑒定Fig.10 RT－PCR identification of transformed plants

3.3 農桿菌菌株對轉化效率的影響

農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，含有致瘤Ti質粒，宿主范圍廣泛，在自然狀態下能通過傷口侵染植物。菌株的侵染能力是轉化中關鍵的因素之一。菌株對材料的轉化能力體現在2個方面：一是農桿菌能否吸附在植物細胞表面，Vir區能否誘導表達，T－DNA能否轉至植物細胞并整合到植物基因組中；二是菌株對植物材料細胞的傷害程度。菌株的侵染能力是轉化中最關鍵的因素之一。農桿菌有效地附著于植物細胞上是保證其TDNA進入寄主植物細胞的前提，因此選擇合適的菌株是轉化成功的必要前提。本實驗使用的農桿菌菌株C58，載體pBI121－CBF1含有CaMV35S啟動子、GUS基因、AtCBF1基因和Kan基因，這為基因的成功轉化提供了很好的條件。

3.4 Kan對轉化率的影響

在選擇壓力下，不含標記基因及其產物的非轉化細胞和組織死亡，而轉化細胞由于有抗性，可以繼續存活，因而有利于從大量的非轉化細胞和組織中選擇出轉化克隆［28，29］。不同植物的外植體對Kan具有不同的敏感性，因此在轉化之前確定合適濃度的Kan，以便在這個合適濃度的選擇壓力下，非轉化細胞的生長能有效地被抑制，緩慢死亡，轉化細胞正常生長，發育［30］。本實驗中，苜蓿的外植體在愈傷階段對Kan不太敏感，需要60mg／L來進行篩選。但過高的選擇壓可能會降低轉化體細胞的分裂活性，致使再生芽出現很少，因此本實驗采用了在其分化和生根階段將Kan濃度降低至20mg／L，有利于轉化率的提高。

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