紫花苜蓿WRKY轉錄因子基因的克隆與亞細胞定位

陳婷婷，楊青川，丁旺，康俊梅，張鐵軍，張新全

（1.四川農業大學草業科學系，四川 雅安625014；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

植物生長發育受多種生物和非生物因素的影響。在長期自然選擇壓力下，植物逐漸形成由轉錄因子調控的基因網絡，進而產生多種生理生化機制來感知和響應各種外界信號［1，2］。在植物體內的轉錄因子中，ERF［3］，bZIP［4］，MYB［5］，NAC［6］和 WRKY［7］家族由于其重要功能而被廣泛研究。WRKY 家族最早由Ishiguro和 Nakamura［8］在白薯（Ipomoeabatatas）中發現，隨后在野生燕麥（Avenafatua）［9］、荷蘭芹（Petroselinumcrispum）［10］、擬南芥 （Arabidopsisthaliana）［11］、煙 草 （Nicotianatabacum）［12－15］、馬 鈴 薯 （Solanumtuberosum）［16，17］、棉 花（Gossypiumarboreum）［18］和水稻（Oryzasativa）［19］中相繼克隆了該家族的成員。目前，小立碗蘚（Physcomitrellapatens）中發現37個WRKY家族成員，而在大豆（Glycinemax）中估計有超過200個該家族成員。WRKY家族成員都包含WRKY構結域和鋅指結構，根據WRKY構結域的個數以及鋅指結構的特征可將WRKY蛋白家族成員分為三類：第Ⅰ類含有2個WRKY構結域，第Ⅱ和第Ⅲ類含有1個WRKY構結域，第Ⅰ類和第Ⅱ類的成員含有 C2－H2（C－X4－5－C－X22－23－H－X－H）鋅指結構，第Ⅲ類的 C2－H2型鋅指結構被 C2－HC（C－X7－C－X23－H－X－C）代替［20，21］。該家族成員與多種生物和非生物脅迫相關，此外還有研究表明該家族成員與植物衰老［22］，物質代謝［23］，種子休眠［24］等相關，總之，植物體內多種生理生化反應都有 WRKY蛋白家族成員的參與。紫花苜蓿（Medicagosativa）是一種優質的豆科牧草［25，26］，近年來在農業種植結構調整過程中發揮越來越重要的作用。本研究利用表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）電子克隆技術結合反轉錄－聚合酶鏈式反應（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）成功從苜蓿中克隆到1個 WRKY轉錄因子基因的cDNA序列，運用生物信息學工具對該序列編碼蛋白進行分析；通過構建瞬時表達載體，運用基因槍轟擊洋蔥（Allium cepa）表皮細胞的方法對該基因編碼蛋白進行亞細胞定位，為進一步驗證該基因功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

“中苜1號”紫花苜蓿由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草研究室提供。挑選干凈飽滿的種子接種于1／2Murashige and Skoog（1／2MS）培養基，置于培養箱中28℃培養，2周后取幼苗于液氮中速凍，－80℃保存備用。實驗于2010年7月－2011年3月進行。

1.2 菌株、試劑與載體

大腸桿菌感受態菌株DH5a、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物公司；克隆載體pMD19－T和M－MLV反轉錄酶購自Takara公司；Trizol試劑購自北京博邁德生物公司；瞬時表達載體pA7－GFP由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草研究室保存及提供；其他常用試劑采用進口分裝或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 電子克隆 以公布的大豆WRKY56基因（GenBank登錄號：EU375348.1）為探針搜索美國國立生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）的苜蓿屬EST數據庫，獲得的EST序列使用CAP3軟件（http：／／pbil.univ－lyon1.fr／cap3.php）拼接為重疊群，運用 ORF Finder軟件（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）對獲得的重疊群進行開放閱讀框分析。

1.3.2 RT－PCR擴增 參照Trizol試劑說明書提取苜蓿幼苗的總RNA，提取的總RNA根據M－MLV反轉錄酶說明書反轉錄獲得cDNA第一鏈。以獲得的cDNA第一鏈為模板，根據電子克隆獲得的序列設計正向引物P1：5′－AACTCTTTTGTCTTTGAGCTTGAAC－3′和 反 向 引 物 P2：5′－TATATATCCTAGATTACTTTGGCCC－3′進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。反應體系為：H2O 34.5μL、buffer 5μL、dNTP 4μL、P1和P2各2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、模板2μL；反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性30 s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環后，72℃延伸5min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶，回收產物連接克隆載體pMD19－T，連接產物轉化大腸桿菌感受態菌株DH5α，在含有氨芐青霉素的Luria－Bertani（LB）固體培養基過夜培養后挑取單菌落，菌液PCR檢測后陽性單菌落送北京華大基因公司測序。

1.3.3 生物信息學分析 目的基因編碼蛋白的等電點和分子量預測運用瑞士生物信息學研究所網站的Compute pI／Mw軟件（http：／／www.expasy.org／tools／pi＿tool.html）進行；疏水性輪廓運用 Protscale軟件（http：／／expasy.org／tools／protscale.html）預測；二級結構使用 PBIL LYON－GERLAND數據庫在線預測，信號肽使用SignalP 3.0軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預測；亞細胞定位情況使用 ProtComp Version 9.0（http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml）軟件預測。用目的基因氨基酸序列利用“BlastP”程序進行相似性比對，下載與之匹配的氨基酸序列，用Clustal X軟件進行多重比對，用進化樹表示目的基因編碼產物與已知同類蛋白質的序列相似性。

1.3.4 克隆載體pMD－MsWRKY56構建 根據獲得的cDNA序列設計引物P3：3′－CTCGAGATGGATTGTTCATCATATATCAAC－5′（下劃線部分為酶切位點XhoⅠ）和P4：3′－ACTAGTATTATTGTGCACCAATCT－TCCTG－5′（下劃線部分為酶切位點SpeⅠ），以cDNA第一鏈為模板，擴增帶有酶切位點的MsWRKY56基因完整編碼區，PCR產物連接克隆載體pMDl9－T并轉化大腸桿菌感受態DH5a。菌體PCR檢測后將含有目的條帶的陽性克隆送北京華大基因公司測序。

1.3.5 表達載體MsWRKY56－GFP構建 限制性內切酶XhoⅠ和SpeⅠ酶切帶有綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）基因的植物表達載體pA7－GFP和克隆載體pMD－MsWRKY56，目的片段連接到載體上，構建表達載體MsWRKY56－GFP。

1.3.6 洋蔥轉化 構建好的表達載體通過基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，以空載體pA7－GFP作為對照，通過綠色熒光蛋白基因在洋蔥表皮細胞內的表達情況對目的基因編碼蛋白進行亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 MsWRKY56基因cDNA序列的獲得

以大豆WRKY56基因為探針搜索苜蓿屬EST數據庫，由獲得的EST序列EST488307（GenBank登錄號：BG586539.1）、EST484458（GenBank登錄號：BG582712.1）、EST489803（GenBank登錄號：BG588028.1）、MTYCD13TF（GenBank登錄號：EV254769.1）、EST430689（GenBank登錄號：BE998966.1）、NF037H12EC1F1103（GenBank登錄號：BF645569.1）和 MEUB956TR（GenBank登錄號：GE352014.1）拼接獲得1個長1 267bp的重疊群，根據拼接的序列設計引物進行RT－PCR擴增，獲得1條1 200bp左右的條帶（圖1），測序后比對發現該序列與其他物種的WRKY家族成員有很高的同源性，將此序列命名為MsWRKY56（GenBank登錄號：JN008710.1），包含1個951bp的最大開放閱讀框，編碼317個氨基酸（圖2）。

圖1 MsWRKY56基因RT－PCR擴增產物Fig.1 RT－PCR amplification of MsWRKY56gene

2.2 MsWRKY56基因編碼蛋白的理化性質分析

生物信息學分析表明MsWRKY56基因編碼蛋白等電點為8.53，相對分子量為35.4kDa，大部分區域表現為親水性（圖3）；二級結構預測表明該蛋白含有大量螺旋和無規卷曲結構（圖4）；該蛋白不包含信號肽，定位于細胞核中。通過系統發育樹（圖5）分析發現，該蛋白與來自大豆的 WRKY56蛋白聚為緊密一支，說明它們的親緣關系較近。

2.3 亞細胞定位載體的構建和重組子鑒定

利用XhoⅠ和SpeⅠ對pMD－MsWRKY56載體和亞細胞定位載體pA7－GFP進行雙酶切，然后純化酶切產物、連接，構建重組表達載體。單克隆經菌落PCR檢測，可擴增出1條1 000bp左右插入片段，與目的片段（951bp）分子量基本相符；通過雙酶切鑒定可在1 000bp左右檢測到目的條帶（圖6），重組質粒經測序表明，與克隆序列完全一致，開放閱讀框正確，表明亞細胞定位載體構建成功。

圖2 MsWRKY56基因序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequence of the MsWRKY56

圖3 MsWRKY56基因編碼蛋白的疏水性結構Fig.3 The hydrophobicity analysis of MsWRKY56protein

圖4 MsWRKY56基因編碼蛋白的二級結構Fig.4 The secondary structure of MsWRKY56protein

2.4 亞細胞定位分析

利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞后，使用共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細胞內綠色熒光蛋白基因的表達情況。結果顯示，沒有導入目的基因的空載體轟擊洋蔥表皮細胞后，整個細胞內都有綠色熒光，而轟擊表達載體MsWRKY56－GFP的洋蔥表皮細胞只在細胞核內有綠色熒光（圖7），表明該基因編碼蛋白定位于細胞核，與之前的生物信息學分析結果相符。

圖5 MsWRKY56與其他WRKY蛋白的進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of MsWRKY56and other WRKYs

圖6 表達載體MsWRKY56－GFP酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion of expression vector MsWRKY56－GFP

3 討論

轉錄因子在生物體生命周期每一過程中發揮重要作用，研究轉錄因子對于揭示生物體生長發育以及對外界環境響應的基因調控網絡具有重要意義。WRKY家族參與調節植物的多種生物學途徑，目前對該家族的研究主要集中于基因克隆與功能鑒定等初級階段，作為一種誘導型轉錄因子，其作用模型尚不清楚。Asai等［27］的研究表明 WRKY轉錄因子的功能受絲裂原激活蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）的調節，植物體內的MAPK、MAPK激酶（MAPKK）和 MAPKK 激酶 （MAPKKK）構成MAP激酶級聯，通過一系列的磷酸化反應將外界信號逐步放大并傳遞到細胞內，引發各種生理生化反應。田云等［28］推測，各種環境誘導因子與細胞膜上的受體作用，通過某種機制激活體內的MAP激酶級聯系統，MAP激酶級聯系統通過一系列的磷酸化反應激活WRKY轉錄因子的活性，WRKY轉錄因子通過與W－box元件發生特異性結合，調節啟動子中含有該元件的相關功能基因或其他調節因子基因的表達，參與植物各種重要生理應答反應。

基于表達序列標簽的電子克隆策略，是近年來發展起來的一門快速克隆基因的新技術，其技術核心是利用生物信息學技術組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長cDNA序列。從GenBank的核酸（nr）數據庫中檢索已測序列植物的目的基因，獲得目的基因cDNA序列，以該序列為模板對另一種未測序列植物EST數據庫進行BLAST檢索，獲得與之部分同源的EST群，從中選取1條EST作為種子序列BLAST檢索該植物的EST數據庫，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群（contig），再以此重疊群序列重復以上BLAST檢索過程，反復進行EST重疊群序列的拼接和比對，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續延伸，最終獲得未測序列植物基因的cDNA全序列。隨著EST數據庫的進一步完善，電子克隆策略已成為克隆新基因的重要方法。與傳統的基因克隆方法相比，電子克隆成本低，速度快，針對性強，廣泛應用于重要功能基因篩選。

植物體內WRKY轉錄因子參與多種生理生化反應，Dong等［29］發現49個擬南芥WRKY基因受丁香假單孢菌（Pseudomonassyringae）和茉莉酸甲酯（SA）誘導；Mare等［30］從大麥中發現一個新的 WRKY轉錄因子基因HvWRKY38，該基因與植物的冷脅迫和干旱脅迫應答相關；仇玉萍等［31］從低溫（4℃）誘導的水稻葉片cDNA文庫中克隆獲得13個WRKY基因，其中有10個WRKY基因的表達受到NaCl、PEG、低溫（4℃）和高溫（42℃）等非生物逆境因子的影響；Yoda等［32］從煙草中克隆到1個WRKY轉錄因子基因，該基因受煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）誘導；Xie等［33］獲得48個WRKY基因全長cDNA序列，其中有4個受ABA誘導表達；Lagace和 Matton［34］，Robatzek和Somssich［35］，Miao等［36］，Luo等［37］的研究表明WRKY基因與植物的生長發育相關，Park等［38］發現擬南芥 WRKY7轉錄因子具有一個鈣調蛋白結合域（calmodulin－binding domain，CaMBD），且能與鈣調蛋白（calmodulin，CaM）結合，表明WRKY轉錄因子在CaM介導的Ca2＋信號轉導過程中具有一定的作用。本研究利用電子克隆與實驗克隆相結合的方法，獲得1個紫花苜蓿WRKY基因家族成員的cDNA序列，通過蛋白比對發現該基因編碼蛋白與大豆WRKY56基因編碼蛋白高度同源。Zhou等［39］的研究表明，大豆WRKY56基因在鹽脅迫，干旱脅迫和寒冷脅迫處理后表達量沒有明顯變化，該基因可能不受非生物脅迫的誘導，其具體功能還有待進一步研究。

目前已有一些方法評價蛋白在生物體內的物理和化學狀態，但是研究蛋白在細胞內的生物活性，需要在活性細胞內檢測到這些蛋白，所以研究蛋白在細胞內的定位情況具有重要意義。研究蛋白亞細胞定位的方法主要有：融合報告基因定位法、免疫組織化學定位法、蛋白質組學定位技術以及共分離標記酶輔助定位法，其中融合報告基因定位法主要使用的報告基因有綠色熒光蛋白（GFP）和β－葡糖酸苷酶（GUS）。通過構建目的基因與綠色熒光蛋白的融合表達載體對編碼蛋白進行亞細胞定位研究，容易操作，實驗周期相對較短，靈敏度高，可以適應于活體實時定位和動態研究，此方法目前被廣泛應用［40］。本研究構建該基因的瞬時表達載體，通過基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的方法發現該基因編碼蛋白定位于細胞核中，這與轉錄因子的特征相符，為進一步研究WRKY轉錄因子的作用模式奠定了基礎。

圖7 洋蔥表皮細胞GFP熒光觀察Fig.7 Fluorescence detection in the onion skins cells

4 結論

本研究采用電子克隆和實驗克隆結合的方法獲得1個紫花苜蓿WRKY轉錄因子家族成員的cDNA序列，該序列長1 267bp，包含1個951bp的最大開放閱讀框，編碼317個氨基酸；生物信息學分析結果表明，該基因編碼蛋白等電點為8.53，相對分子量為35.4kDa，大部分區域表現為親水性，包含大量螺旋和折疊結構，不包含信號肽，定位于細胞核中；通過構建該基因的瞬時表達載體，運用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的方法對該基因編碼蛋白的亞細胞定位情況進行分析，該基因編碼蛋白定位于細胞核中，與生物信息學分析相符，表明生物信息學分析軟件預測的結果具有一定的可靠性。

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