柳枝稷人工穗芽高效再生體系的建立

柴乖強(qiáng)，徐開(kāi)杰，王勇峰，孫風(fēng)麗，宋立立，劉曙東，奚亞軍＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.滄州師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 滄州061001）

隨著社會(huì)的發(fā)展，人類對(duì)能源的需求日益劇增。然而全球化石能源的不可再生性以及大量使用導(dǎo)致了大氣污染、全球氣候變暖等一系列環(huán)境問(wèn)題［1，2］。因此，尋求一種新的可再生替代能源成為擺在人們面前的一項(xiàng)重要的工作。柳枝稷（Panicumvirgatum）原產(chǎn)于北美，屬禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum），是一種多年生暖季型草本C4植物［3，4］，通常被用來(lái)放牧、水土保持以及生態(tài)建設(shè)。與傳統(tǒng)作物相比，柳枝稷的抗旱能力強(qiáng)、耐瘠薄、病蟲(chóng)害少、生物學(xué)產(chǎn)量高，加上易播種出苗和建立植被以及纖維素和半纖維素能較高地轉(zhuǎn)化為乙醇等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被國(guó)際上廣泛作為一種理想的生物能源植物并進(jìn)行了深入研究［5－8］。保存和快速繁殖優(yōu)質(zhì)原始材料是支撐現(xiàn)代生物育種技術(shù)發(fā)展的重要內(nèi)容之一。為了適應(yīng)現(xiàn)代生物育種工作的需要，柳枝稷的離體培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)受到了越來(lái)越多的重視。孟敏等［9］、Jason等［10］均以柳枝稷幼穗和成熟種子為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)胚性愈傷組織增殖出大量的柳枝稷幼苗。然而，由于柳枝稷在人工誘導(dǎo)愈傷組織方面受基因型限制，且存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)，再生率低等缺點(diǎn)，使其在柳枝稷離體培養(yǎng)和快速繁殖上的應(yīng)用受到了一定限制。

利用植物不同器官作為外植體誘導(dǎo)叢生芽進(jìn)而建立高效再生體系，是組織培養(yǎng)最直接、最簡(jiǎn)便、成苗速度最快的途徑之一［11］。迄今已有多種植物利用芽頂端分生組織［12－17］或莖節(jié)［18］為外植體誘導(dǎo)叢生芽，從而建立了其植株再生體系。而通過(guò)幼穗直接誘導(dǎo)人工穗芽目前還未見(jiàn)報(bào)道。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，在人工誘導(dǎo)柳枝稷的幼穗形成過(guò)程中，通過(guò)人工處理可獲得少量幼芽（人工穗芽），在適宜培養(yǎng)基上誘導(dǎo)和人工促進(jìn)可使穗芽在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增，通常形成包含數(shù)十條或一百余條不等的穗芽塊，為避開(kāi)傳統(tǒng)通過(guò)胚性愈傷組織再生植株建立了一條簡(jiǎn)便易行的途徑。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)柳枝稷人工穗芽的培養(yǎng)條件、處理方法等進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期建立較為高效的柳枝稷人工穗芽再生體系，為柳枝稷的離體繁殖乃至生物技術(shù)育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為‘西稷1號(hào)’、‘西稷2號(hào)’和‘西稷3號(hào)’3個(gè)基因型，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院柳枝稷分子育種課題組選育提供。試驗(yàn)于2010年8月－2011年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥改良中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試驗(yàn)初始培養(yǎng)基 誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基：MS（Murashige and Skoog）＋3.00mg／L 6－BA（6－Benzylamin－opurine）＋3.00%蔗糖＋0.75%瓊脂，pH 值5.8；生根培養(yǎng)基：1／2MS＋1.00%蔗糖＋0.70%瓊脂，pH 值5.8。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因素尋優(yōu)的方法，以誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基為初始基本培養(yǎng)基，各單因素試驗(yàn)依次以前一試驗(yàn)研究結(jié)果為基礎(chǔ)，依次從柳枝稷的基因型、幼穗長(zhǎng)度、激素、初次切割時(shí)期穗芽長(zhǎng)度、大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式和生根培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)因素的優(yōu)化選擇，以建立柳枝稷人工穗芽高效再生體系。試驗(yàn)各因素包括水平如下：基因型三水平包括西稷1號(hào)、西稷2號(hào)、西稷3號(hào)；幼穗長(zhǎng)度四水平包括0.5，1.0，1.5和2.0cm；激素處理五水平分別為2.00mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D，2.50mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D，3.00mg／L 6－BA，3.00mg／L 6－BA＋0.10mg／L 2，4－D，MS＋3.50mg／L 6－BA；初次切割時(shí)期穗芽長(zhǎng)度四水平包括初次穗芽長(zhǎng)度0.5，1.0，1.5和2.0cm；大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度四水平包括穗芽長(zhǎng)1.0，1.5，2.0和2.5cm；碳源三水平包括30g／L蔗糖、30g／L麥芽糖、30g／L甘露醇；pH 值五水平分別為5.4，5.6，5.8，6.0，6.2；穗芽塊的切割方式兩水平包括橫切和縱切；4種生根培養(yǎng)基分別為1／2MS、1／2MS＋0.5mg／L IBA、1／2MS＋0.5mg／L NAA 和1／2MS＋0.5mg／L IBA＋0.5mg／L NAA。

1.2.2 外植體的準(zhǔn)備與誘導(dǎo) 在柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育至有5～6個(gè)節(jié)時(shí)，人工剝?nèi)?cm左右的穗下莖節(jié)。先用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精表面消毒1min，倒掉酒精后加入適量體積分?jǐn)?shù)為5%的NaClO（有效氯≥0.9%）溶液滅菌約1～2min，再用無(wú)菌水沖洗3～4次。

將滅好菌的幼穗用無(wú)菌手術(shù)刀從中間縱切成兩半，根據(jù)各試驗(yàn)進(jìn)程，依次分別接種到上述各培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種3個(gè)幼穗。并置于28℃，光照16h／d，光照強(qiáng)度12 000lx的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每次從誘導(dǎo)好的穗芽基部2mm處切去穗芽，人工切割5次后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)調(diào)查統(tǒng)計(jì)人工穗芽的數(shù)目。穗芽的誘導(dǎo)過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 柳枝稷人工穗芽培養(yǎng)Fig.1 Artificial ear buds formation of switchgrass

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法 調(diào)查人工穗芽的增殖效率、生根率和幼苗移栽成活率。計(jì)算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

西稷1號(hào)、西稷2號(hào)和西稷3號(hào)3個(gè)基因型的外植體接種后誘導(dǎo)出幼穗的時(shí)間存在差異（表1），其中西稷1號(hào)和西稷3號(hào)誘導(dǎo)出幼穗的時(shí)間相同，但西稷2號(hào)則較西稷1號(hào)和西稷3號(hào)延長(zhǎng)了2d，表明西稷2號(hào)的幼穗誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)。

不同基因型對(duì)柳枝稷幼穗的增殖效率存在差異，其中，西稷1號(hào)基因型的幼穗增殖效率最高，西稷2號(hào)幼穗增殖效率最低，西稷3號(hào)的幼穗增殖效率介于兩者之間。方差分析結(jié)果表明，西稷1號(hào)的增殖效率顯著高于西稷3號(hào)（P＜0.05），而極顯著高于西稷2號(hào)（P＜0.01），西稷2號(hào)和西稷3號(hào)之間的差異也達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。說(shuō)明西稷1號(hào)為較理想的基因型，其次為西稷3號(hào)，而西稷2號(hào)基因型的增殖效果最差。

表1 基因型對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 1 Effects of genotype on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表2 幼穗長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 2 Effects of young panicle length on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.2 幼穗長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

選用西稷1號(hào)基因型的柳枝稷誘導(dǎo)穗芽，結(jié)果表明（表2），不同長(zhǎng)度西稷1號(hào)基因型的幼穗對(duì)柳枝稷人工穗芽的增殖效率有很大的影響。隨著幼穗長(zhǎng)度的增加，增殖效率呈先增后減的趨勢(shì)，而取長(zhǎng)度為1.5 cm的幼穗時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為1 600.00%。方差分析表明，長(zhǎng)度為1.5cm的幼穗增殖效率極顯著高于其他長(zhǎng)度的幼穗（P＜0.01）。因此，選用西稷1號(hào)基因型長(zhǎng)度為1.5cm的幼穗進(jìn)行穗芽增殖較為理想。

2.3 生長(zhǎng)激素配比對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

6－BA是一種高效的植物細(xì)胞分裂素，它調(diào)控細(xì)胞核基因的活性和蛋白質(zhì)的磷酸化與翻譯［19］。6－BA對(duì)西稷1號(hào)基因型柳枝稷的長(zhǎng)度為1.5cm幼穗的穗芽增殖有明顯的促進(jìn)作用，且其促進(jìn)作用在6－BA濃度為3.0mg／L時(shí)達(dá)到最高，其后則呈減弱趨勢(shì)（表3）。適量2，4－D的加入，也會(huì)明顯增加柳枝稷的穗芽增殖效率。初始基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)激素組合為3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為2 333.33%。經(jīng)方差分析，3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D激素組合與3.0mg／L 6－BA 和3.5mg／L 6－BA 的穗芽增殖效率差異不顯著，而顯著高于激素組合2.5 mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D（P＜0.05），極顯著高于2.0mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D（P＜0.01）。由于激素組合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D的穗芽增殖效率略高于生長(zhǎng)激素3.0mg／L 6－BA，因此在西稷1號(hào)基因型柳枝稷穗芽再生體系后期試驗(yàn)中采用激素組合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D。

2.4 初次切割時(shí)期穗芽長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在利用前期基因型、幼穗長(zhǎng)度、生長(zhǎng)激素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，初次切割時(shí)穗芽的長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率有著顯著的影響，且穗芽的增殖效率隨著初次切割時(shí)穗芽長(zhǎng)度的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)（表4）。初次切割穗芽長(zhǎng)1.5cm時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，達(dá)到2 433.33%。方差分析表明，初次切割長(zhǎng)度為1.5cm時(shí)的穗芽增殖效率與長(zhǎng)度為1.0，2.0和2.5 cm的穗芽增殖效率間的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。因此，初次切割時(shí)期選擇穗芽長(zhǎng)度1.5cm較為理想。

表3 生長(zhǎng)激素對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 3 Effects of phytohormone on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.5 大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度對(duì)增殖效率有著顯著的影響，且穗芽的增殖效率隨著穗芽長(zhǎng)度的增加呈現(xiàn)出先大幅升高其后則呈降低的趨勢(shì)（表5）。當(dāng)穗芽長(zhǎng)度為1.5cm時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，達(dá)到3 400.00%。方差分析表明，大量培養(yǎng)階段柳枝稷穗芽長(zhǎng)度為1.5cm時(shí)分離，其穗芽增殖效率與長(zhǎng)度為1.0，2.0和2.5cm的穗芽增殖效率間的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。因此，大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度選擇1.5cm進(jìn)行增殖較為理想。

表4 初次切割時(shí)期穗芽長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 4 Effects of spike buds length of first cutting time on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.6 碳源對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

結(jié)合基因型、幼穗長(zhǎng)度、生長(zhǎng)激素、初次切割時(shí)期和大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度試驗(yàn)研究結(jié)果，培養(yǎng)基采用不同碳源對(duì)柳枝稷穗芽的增殖效率有顯著的影響，其中以麥芽糖作為碳源時(shí)柳枝稷穗芽的增殖效率最高，為3 633.33%（表6）。經(jīng)方差分析，麥芽糖、蔗糖和甘露醇3種碳源的培養(yǎng)基對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率存在差異，其中碳源為麥芽糖的穗芽增殖效率顯著高于蔗糖（P＜0.05），且極顯著的高于甘露醇的穗芽增殖效率（P＜0.01），而碳源為蔗糖或甘露醇時(shí)兩者之間差異不顯著。因此在穗芽培養(yǎng)中選用麥芽糖作為碳源較為理想。

表5 大量培養(yǎng)階段穗芽長(zhǎng)度對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 5 Effects of spike buds length of mass culturing stage on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表6 碳源對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 6 Effects of carbon source on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.7 培養(yǎng)基pH值對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基pH值對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率有顯著影響，增殖效率隨著培養(yǎng)基pH值的升高呈現(xiàn)出先迅速升高后緩慢下降的趨勢(shì)（表7）。在培養(yǎng)基pH為5.8時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為3 766.67%。方差分析表明，培養(yǎng)基pH值為5.8時(shí)穗芽增殖效率與pH值6.0和6.2之間差異不顯著，而極顯著高于pH值為5.4和5.6時(shí)的穗芽增殖效率（P＜0.01）。因此，培養(yǎng)基pH值應(yīng)控制在5.8～6.2時(shí)較理想，但以pH值為5.8時(shí)的增殖效率最好。

2.8 大量培養(yǎng)階段穗芽塊的切割方式對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，切割方式采用縱切時(shí)，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為4 166.67%（表8）。方差分析表明，采用縱切和橫切2種切割方式時(shí)，幼穗增殖效率之間差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。因此，叢生芽的切割方式以縱切最為理想。

表7 培養(yǎng)基pH對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 7 Effects of pH value on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.9 生根培養(yǎng)基對(duì)成苗的影響

良好的根系發(fā)育，是穗芽發(fā)育成苗乃至正常生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。利用基因型、幼穗長(zhǎng)度、激素、初次切割時(shí)期、大量培養(yǎng)階段穗芽分離時(shí)期、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式試驗(yàn)研究結(jié)果，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的穗芽，分別轉(zhuǎn)至4種不同的生根培養(yǎng)基中，20d有不定根生成，45d后調(diào)查生根率。并將生好根的幼苗移栽至溫室，2周后調(diào)查成活率。結(jié)果表明（表9），采用1／2MS作為生根培養(yǎng)基時(shí)，柳枝稷的生根率和移栽成活率均達(dá)到最大。因此，采用1／2MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基較為理想。

表8 穗芽的切割方式對(duì)柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 8 Effects of cutting way on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)增殖效率受到外植體類型、培養(yǎng)方式、基本培養(yǎng)基、植物激素組合和濃度等的影響。而植物材料的基因型是影響植物叢生芽誘導(dǎo)的一個(gè)重要因素，一般情況下，同屬不同種之間叢生芽的再生率存在較大的差異，即使在同種不同品種間也有較大差異［20］。在本試驗(yàn)中，筆者通過(guò)對(duì)柳枝稷3種基因型幼穗離體再生研究，發(fā)現(xiàn)西稷1號(hào)基因型穗芽的增殖效率最高，證明在柳枝稷穗芽增殖過(guò)程中存在基因型決定增殖效率的現(xiàn)象。

表9 生根培養(yǎng)基對(duì)幼苗移栽成活率的影響Table 9 Effects of rooting medium on transplanting survival rate of seedling

在植物組織培養(yǎng)中，植物的器官分化決定于植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素的比例，其中6－BA可以有效地誘導(dǎo)芽的萌發(fā)與不定芽的增殖，這是因?yàn)?－BA是一種高效的植物細(xì)胞分裂素，它調(diào)控細(xì)胞核基因的活性和蛋白質(zhì)的磷酸化與翻譯［21－23］。柳枝稷穗芽培養(yǎng)的成功與否也依賴于外源激素，6－BA和2，4－D在幼穗培養(yǎng)和穗芽組織塊形成中起著十分重要的作用。在本試驗(yàn)中，以柳枝稷幼穗為外植體誘導(dǎo)穗芽的發(fā)生依賴于適宜濃度的6－BA，尤以6－BA 3.0mg／L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基效果最好。這與在黑麥草（Loliumperenne）、早熟禾（Poa pratensis）、翠竹（Sasapygmaea）、大花蕙蘭（Cymbidium）等的研究結(jié)果相同［17，24－27］。另外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在柳枝稷穗芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基中，少量2，4－D的加入會(huì)提高柳枝稷的穗芽增殖效率，且2，4－D濃度為0.10mg／L時(shí)最理想。

碳源是植物組織培養(yǎng)中重要的營(yíng)養(yǎng)源，它不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。近年來(lái)，各種糖類對(duì)植物組織培養(yǎng)的效應(yīng)，引起廣泛關(guān)注［28］。研究表明，不同植物對(duì)不同碳源種類的反應(yīng)不完全相同［29］。在本試驗(yàn)中，不同碳源對(duì)柳枝稷穗芽的增殖效率由高到低依次是麥芽糖＞蔗糖＞甘露醇，麥芽糖雖比蔗糖高，但麥芽糖與蔗糖相比價(jià)格昂貴，從試驗(yàn)成本的因素來(lái)考慮采用蔗糖較為合適。

本試驗(yàn)以柳枝稷幼穗為外植體，依次從基因型、幼穗長(zhǎng)度、激素、初次切割時(shí)期、大量培養(yǎng)階段穗芽分離時(shí)期、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式和生根培養(yǎng)基等9個(gè)方面對(duì)柳枝稷人工穗芽再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，初步建立起柳枝稷人工穗芽高效再生體系，該體系可用于柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程研究以及種質(zhì)保存和快速繁殖。此外，該體系具有試驗(yàn)周期短、植株再生頻率高、基因型約束較小和取材不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)中柳枝稷人工穗芽再生體系是通過(guò)單因素尋優(yōu)的方法獲得的，沒(méi)有綜合考慮各因素間的相互作用，因此，下一步試驗(yàn)將采用正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)對(duì)初步獲得的再生體系進(jìn)行優(yōu)化。

［1］侯新村，范希峰，武菊英，等.纖維素類能源草在京郊地區(qū)的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)價(jià)值評(píng)價(jià)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（6）：12－17.

［2］陳序.能源牧草堪當(dāng)未來(lái)生物能源之大任［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：1－5.

［3］Sanderson M A，Reed R L，Mclaughlin S B，etal.Switchgrass as a sustainable bioenergy crop［J］.Bioresource Technology，1996，56（1）：83－93.

［4］劉吉利，朱萬(wàn)斌，謝光輝，等.能源作物柳枝稷研究進(jìn)展［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（3）：232－240.

［5］胡松梅，龔澤修，蔣道松.生物能源植物柳枝稷簡(jiǎn)介［J］.草業(yè)科學(xué)，2008，25（6）：9－33.

［6］Porter C L.An analysis of variation between upland and lowland switchgrass（PanicumvirgatumL）［J］.Ecology，1966，47：980－992.

［7］Keshwani D R，Cheng J J.Switchgrass for bioethanol and other value－added applications：A review［J］.Bioresource Technology，2009，100：1515－1523.

［8］Mclaughlin S B，Kszos L A.Development of switchgrass as a bioenergy feedstock in the united states［J］.Biomass and Bioenergy，2005，28（6）：515－535.

［9］孟敏，李華軍，徐開(kāi)杰，等.柳枝稷的組織培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（4）：1477－1478.

［10］Jason N B，David G J，Blake L J，etal.An improved tissue culture system for embryogenic callus production and plant regeneration in switchgrass（PanicumvirgatumL.）［J］.Bioenergy Research，2009，2：267－274.

［11］劉芳，韋鵬霄，岑秀芬，等.外植體和基本培養(yǎng)基對(duì)臺(tái)灣金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的影響［J］.北方園藝，2009，（4）：103－104.

［12］劉宣雨，劉樹(shù)君，宋松泉.建立甜高粱高頻、高效再生體系的研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（23）：4963－4969.

［13］張杰，李和平，廖玉才，等.小麥莖尖叢生芽誘導(dǎo)及植株再生［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（4）：403－407.

［14］任振勝，卿冬進(jìn)，李有志，等.雜交玉米的叢生芽的誘導(dǎo)植株再生和轉(zhuǎn)化［J］.分子植物育種，2007，5（3）：324－328.

［15］王娟.草地早熟禾高效叢生芽體系的建立［J］.草業(yè)與畜牧，2009，163（6）：42－45.

［16］Ganeshan S，Baga M，Harvey B L，etal.Production of multiple shoots from thidiazuron－treated mature embryos and leafbase／apical meristems of barley［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，73：57－64.

［17］劉珍，袁慶華，王瑜，等.多年生黑麥草高頻叢生芽增殖培養(yǎng)體系的研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18（4）：576－583.

［18］馮波，段嬌嬌，武國(guó)強(qiáng)，等.多漿旱生植物霸王高頻組培再生體系的建立［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（6）：140－146.

［19］王兆龍，曹衛(wèi)星.細(xì)胞分裂素對(duì)植物基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］.植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：82－88.

［20］李杰，黃敏仁，王明庥，等.大花蕙蘭不同基因型組培繁殖系數(shù)的差異［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29（1）：98－100.

［21］閆帆，孫昕，翟瑩，等.6－BA濃度及基因型對(duì)大豆胚尖誘導(dǎo)叢生芽的影響［J］.大豆科學(xué)，2011，30（1）：29－32.

［22］謝寅峰，張志敏，尚旭嵐，等.青錢(qián)柳莖段腋芽萌發(fā)和叢生芽增殖［J］.林業(yè)科學(xué)，2011，47（1）：50－55.

［23］張兆功，邵登魁，李莉，等.NAA、6－BA對(duì)不同熟性甘藍(lán)子葉期愈傷組織誘導(dǎo)的影響及其叢生芽發(fā)生［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：128－132.

［24］姜素云，胡哮瑞.黑麥草高效叢生芽的發(fā)生及離體開(kāi)花的初步研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（6）：100－106.

［25］楊愛(ài)芳，何春梅，王賢麗，等.黑麥草幼穗離體培養(yǎng)及植株再生［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（5）：84－90.

［26］張春霞，羅仁祥.翠竹的組織培養(yǎng)和快速繁殖［J］.植物生理學(xué)通訊，2010，46（5）：477－478.

［27］汪金蘭，周輝明，羅慶國(guó)，等.6－BA、NAA不同配比對(duì)大花蕙蘭叢生芽增殖的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，1：85－86.

［28］Al－Khateed A A.Regulation of in vitro bud formation of date palm （PhoenixdactyliferaL.）cv.Khanezi by different carbon sources［J］.Bioresource Technology，2008，99：6550－6555.

［29］藍(lán)祖栽，黎穎菁，凌征柱，等.不同碳源對(duì)草珊瑚叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（3）：6－7.