柑橘內參基因的穩(wěn)定性評價

摘要： 【目的】為了篩選在柑橘中穩(wěn)定表達的內參基因，以確保柑橘基因表達分析結果的可靠性。【方法】選取Actin、18SrRNA、rpII、GAPDH、UBQ10、UBQ1作為候選內參基因，以geNorm、Normfinder、BestKeeper 以及RefFinder軟件分析這6個基因在冰糖橙的根、莖、葉、果實以及干旱、低溫、潰瘍病、衰退病脅迫下葉片中的表達穩(wěn)定性。【結果】結果表明，在不同柑橘器官及不同脅迫處理下的柑橘葉片中，候選內參基因的表達穩(wěn)定性確實存在差異。在不同柑橘器官之間比較用UBQ10和rpII；干旱脅迫下用GAPDH、18SrRNA和 Actin；低溫脅迫下用UBQ10、Actin和18SrRNA；潰瘍病菌侵染脅迫下用Actin、UBQ10和GAPDH；感染衰退病毒時用18SrRNA和rpII。【結論】為了獲得較為穩(wěn)定的表達分析結果，建議根據(jù)不同的試驗內容選擇不同的內參基因組合。

關鍵詞： 柑橘； 內參基因； 穩(wěn)定性評價； RT-qPCR； 基因表達分析

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2012？雪06-978-07

RT-qPCR因其靈敏度高、特異性強、可用于低豐度mRNA的表達分析而成為廣泛應用的基因表達分析技術[1]。為了確保試驗結果的準確性和可靠性，RT-qPCR需要選用合適的內參基因來消除不同樣品在RNA產(chǎn)量、質量以及反轉錄效率上可能存在的差別，從而實現(xiàn)對不同樣品中RNA的定量和數(shù)據(jù)歸一化。作為基因表達分析時用于衡量目的基因表達量的參照標準，內參基因常為表達相對穩(wěn)定的持家基因。但最近的研究表明，在不同的組織、器官，不同的發(fā)育階段以及不同處理條件下，這些持家基因的表達也會發(fā)生變化，盲目地選用持家基因作為內參基因，就會導致基因表達分析結果準確性降低甚至得到相反或錯誤的結論[2]。因此選擇合適、穩(wěn)定的內參基因非常關鍵。geNorm[3]、NormFinder[4]、BestKeeper[5]等程序以及Delta CT法[6]已廣泛應用于內參基因的篩選與評價。Xie等[7]將這上述4種分析方法整合成一個網(wǎng)上綜合分析工具——RefFinder，用于各種試驗條件下內參基因的篩選與評價，能夠得到與單獨使用各分析方法一致的結果，并能綜合評價上述4種分析方法的結果，避免了單個分析方法分析的片面性。目前，國內外研究者已應用上述分析方法在多種植物中進行了內參基因的篩選。前人對柑橘內參基因也進行了一些初步篩選，在干旱脅迫下的Swingle 枳柚（Poncirus trifoliata×Citrus paradisi）中[8]、在感染柑橘腳腐病菌（Phytophthora parasitica）后的枳（P. trifoliata）、酸橘（C. sunki）以及2者的雜種中[9]分別篩選過一些內參基因，但都是局限于少數(shù)試驗條件下的分析。Mafra等[10]分析了候選內參基因在柑橘不同器官及不同生物脅迫下的穩(wěn)定性，結果表明不同試驗條件下最佳的內參基因組合不相同。Yan等[11]在6個不同基因型的柑橘葉中，從7個候選內參基因中篩選出最穩(wěn)定的3個內參基因，到冰糖橙的不同器官中進行驗證時，也發(fā)現(xiàn)它們的表達差異很大且穩(wěn)定性順序與在不同基因型中的也不一致。因此根據(jù)特定的試驗條件選擇可靠的內參基因很有必要。于是我們基于柑橘中常用基因表達分析的要求，以湖南省特色主栽品種冰糖橙的4種不同器官（根、莖、葉、果實）及干旱、低溫、潰瘍病、衰退病脅迫下的冰糖橙葉片為試材，分析了6個候選內參基因的表達穩(wěn)定性情況，旨在為上述各種試驗條件選定穩(wěn)定表達的內參基因，從而為柑橘研究中的基因表達分析提供較為可靠的內參基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料與脅迫處理

1.2 方法

1.2.2 引物設計與合成 候選內參基因的引物來自Yan等[11]設計的引物，由上海生工合成。

2 結果與分析

3 討 論

本研究的候選內參基因選自Yan等[11]在不同柑橘基因型中表達相對穩(wěn)定的基因（M<1.0），而且Tomas等[18]的研究表明在特定的試驗條件與特定組織中表達穩(wěn)定的內參基因在其同源物種的相同組織及相同試驗處理下表達也相對穩(wěn)定，因此本研究篩選出的枳砧冰糖橙不同組織和不同逆境脅迫下的內參基因組合也將會對其他基因型柑橘有一定參考價值。此外，前人的研究[10，19-20]， 建議根據(jù)特定的試驗內容進行內參基因的選擇；Tomas等[18]研究證明根據(jù)特定的試驗條件篩選的內參基因，其表達穩(wěn)定性強于在各種條件下表達都穩(wěn)定的基因；本研究中在對所有柑橘樣品進行整體分析時也發(fā)現(xiàn)候選內參基因的表達穩(wěn)定性下降，因此為了獲得較為穩(wěn)定的表達分析結果，建議根據(jù)不同的試驗內容進行柑橘內參基因的選擇。另外本研究在利用geNorm軟件的Vn/n+1值進行最佳內參基因數(shù)目的確定時發(fā)現(xiàn)，在候選內參基因相對不穩(wěn)定時，V值遠離異于默認值，此時選擇內參基因組合就不太必要。但當候選內參基因相對穩(wěn)定，V值落在默認值附近時，建議選擇合適的內參基因組合。

本研究所用的內參基因穩(wěn)定性評價軟件中，Delta CT法與Normfinder表現(xiàn)出高度的一致性；geNorm與Normfinder在整體分析、不同器官分析、潰瘍病、衰退病感染下的分析中表現(xiàn)出高度的一致性，但在干旱、低溫脅迫的分析中則出現(xiàn)了一定差異；BestKeeper的分析與上述3種方法的分析差異較大。上述各種軟件計算結果的差異源于算法的不同，geNorm根據(jù)各候選內參基因在各樣品中表達情況的相似度進行排序，而NormFinder則根據(jù)組內方差與組間方差進行排序；只有一個內參基因在組間與其他內參基因的表達表現(xiàn)出差異，而這個內參基因自身在組間各樣品中沒差異時，geNorm會最先排除這個基因，NormFinder則會將其排到最前面[4]；因此當內參基因本身在組間各樣品間的差異較少時，geNorm與Normfinder的分析結果差異較大；Bestkeeper則直接依賴于Cq值的配對相關分析，是最直接反應原始數(shù)據(jù)的，在對內參基因的穩(wěn)定性進行排序上沒有geNorm與Normfinder有效，通常用其進行初步篩選[21]，這也許是BestKeeper與其他算法差異較大的原因。為減少算法不同所導致的單個軟件分析的片面性，本研究進一步利用一個網(wǎng)上綜合分析工具—RefFinder，對各組數(shù)據(jù)進行分析，一方面驗證各軟件的分析結果，另一方面對候選內參基因進行綜合評價。

本研究中UBQ1經(jīng)多次試驗去除離異值后對其Cq平均值作圖發(fā)現(xiàn)，它的表達相對較穩(wěn)定。但因其表達豐度過低，其Cq值處于判斷有無擴增的臨界值（30～40）內，極易因樣品的異質性產(chǎn)生隨機效應而導致錯誤的判斷[22-24]，同時理想內參基因應中度表達[25-27]，Cq值應在15～30[26-27]，故本試驗舍棄UBQ1作為柑橘的內參基因。理想內參基因需中度表達[25-27]，也要求表達水平需與目的基因相近[25-27]。假如目的基因表達水平極低，則用中度表達的內參基因就不太適合，此時低豐度表達的內參基因就較為合適。這時如何避免由于低豐度表達帶來的Cq值的不穩(wěn)定性就尤為重要。對于穩(wěn)定表達的低豐度內參基因的篩選還有待進一步研究。

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