刺梨莖尖的玻璃化超低溫保存及植株再生

摘要： 【目的】建立刺梨莖尖超低溫保存技術體系，為刺梨種質資源的長期穩定保存提供新途徑。【方法】以刺梨為材料，研究了適合莖尖超低溫保存的蔗糖預培養時間與濃度、預處理時間、玻璃化液處理時間等影響因素。【結果】適合超低溫保存芽誘導的適宜培養基為MS+0.5 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。刺梨莖尖玻璃化法超低溫保存體系為：約0.5 cm長的腋芽莖尖在4 ℃條件下于培養基MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA +0.3 mo1·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂上預培養3 d，切取約2 mm長的莖尖，室溫下LS裝載液處理40～50 min，然后用玻璃化液PVS2 于0 ℃下處理40 min，換入新鮮的PVS2，迅速投入液氮中。保存24 h后，在40 ℃水浴中化凍，用MS+1.2 mol·L-1蔗糖+100 mg·L-1 Vc+0.5 mg·L-1 GA3培養基洗滌2次，接種到MS+0.3 mol·L-1蔗糖的培養基上暗培養1 d，再轉接到MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂上暗培養7 d后轉入正常光下培養，成活率可達44.3%。【結論】建立了刺梨莖尖超低溫保存技術體系。

關鍵詞： 刺梨； 莖尖； 超低溫保存； 玻璃化法

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2012？雪06-1069-05

2 結果與分析

2.1 刺梨無菌材料的建立

2.2 不同濃度6-BA對刺梨微莖尖培養的影響

2.3 預培養蔗糖濃度對超低溫保存結果的影響

2.4 預培養時間對超低溫保存結果的影響

2.5 裝載液（LS）預處理時間對超低溫保存結果的影響

裝載預處理是一個滲透保護的處理過程，可以初步降低組織的含水量，避免由于滲透壓變化太強而對材料造成傷害[1]。

圖3結果顯示，LS裝載液預處理對超低溫保存效果有明顯的影響。不經過裝載液處理的莖尖幾乎

2.6 玻璃化液（PVS2）處理時間對超低溫保存結果的影響

2.7 解凍后的形態發生與植株再生

3 討 論

在植物莖尖超低溫保存研究中，大多以繼代苗的莖尖作為保存材料[1，11-13]，可能是因為通過繼代培養可以提高細胞分裂與分化的同步化頻率，從而提高超低溫保存的存活率。但本研究中，刺梨繼代苗的莖尖長勢弱，莖尖不明顯，而采用初代誘導苗的腋芽大、健壯，莖尖明顯，適合作超低溫保存材料，這在葡萄[5]、柿[12]離體莖尖超低溫保存中，也發現頂芽莖尖保存后不易成活，而腋芽莖尖保存后再生率較高的現象。要使保存后的莖尖能夠成活，莖尖的大小要適當。過大不利于脫水，過小易造成機械損傷。因此，在剝取莖尖時，一定要盡量減少機械損傷，這也是刺梨保存成功的關鍵。本試驗切取刺梨莖尖長度為2 mm左右，保存效果較好。

一般情況下，在進行植物莖尖超低溫保存前，對材料進行預培養，可以提高超低溫保存后的成活率。用高濃度的蔗糖進行預培養是較為常用的方法，但本研究先期僅選用高濃度蔗糖進行預培養，保存效果不好，成活率低。而改用高濃度蔗糖結合低溫（4 ℃）對刺梨莖尖進行預培養，保存效果較好。預培養除了要求方法適當外，預培養的時間也要適宜。本研究預培養3 d，保存效果較好，而預培養時間過長或過短，則成活率都會降低，這與前人研究結果一致[9，13]。此外，蔗糖濃度過高或者預培養時間過長，材料會出現黃化、水漬化和生活力降低甚至死亡的現象，可能是由于材料脫水過度、細胞產生了滲透脅迫所致。

本研究發現，在恢復培養時不進行暗培養或暗培養時間少于7 d，刺梨莖尖幾乎不能成活，因此，恢復培養初期進行一定時間的暗培養至關重要。在桃莖尖超低溫保存過程中也發現，化凍后的莖尖通過15 d的暗培養后，可顯著提高其成活率，若直接在光下培養，成活率極低[13]。在刺梨莖尖恢復培養初期，進行更長時間的暗培養是否還可提高其成活率，有待進一步研究。

本研究對刺梨莖尖的超低溫保存取得了重要結果，但其保存后成活率還比較低，還需對超低溫保存的程序和方法進行優化。（本文圖版見插2）

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