火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究

摘要：為了探討火炭母（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．）有效成分的抗氧化作用，采用超聲波輔助手段對火炭母中的有效成分進行了提取，并用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋體系法和鄰苯三酚體系法對其抗氧化活性進行了研究。結果表明，當采用甲醇與水體積比為１∶１混合液為提取溶劑時，火炭母提取液具有較高的抗氧化活性，４０ ｇ原材料的提取液對羥自由基的清除效果與６．２９ ｇ維生素Ｃ的作用相當，而對超氧陰離子的清除效果與９．８２ ｇ維生素Ｃ的作用相當。

關鍵詞：火炭母；抗氧化；羥自由基

中圖分類號：Ｑ９４９．７４４；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2490-03

Effective Component Extracting and Its Antioxidant Activity in Polygonum chinense

ＨＵＡＮＧ Ｇｕｏ－ｘｉａ１，ＬＩＵ Ｌｉｕ１，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｚｉ－ｍｅｉ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｕｚｈｏｕ ５４５００６，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｌｉｕｚｈｏｕ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｉｕｚｈｏｕ ５４５００６，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Iｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ． ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｄｊａｃｅｎｔ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗed ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｗａｓ １∶１． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ４０ｇ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｅｑｕａｌ ｔｏ ６．２９ ｇ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ， ａｎｄ ｅｑｕａｌ ｔｏ ９．８２ ｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ； ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ

火炭母（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｌ．）為蓼科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）植物，生長于水溝邊、山谷、濕地上，具有清熱利濕、涼血解毒等功效，可用于濕熱泄瀉、痢疾、黃疸、咽喉腫痛、濕熱瘡疹、霉菌性陰道炎等病癥的治療［１］，是廣東地區常用的中草藥。已有人用１０％的火炭母滴眼液治療角膜薄翳、角膜斑翳等眼疾［２］。火炭母中的藥用成分主要為黃酮、生物堿、芳香雜環類化合物等［３］，朱華等發現，火炭母中含有豐富的槲皮素［４］。

自由基具有強氧化性，可損壞機體組織和細胞，過量自由基的產生是人體衰老及各種疾病產生的誘導因素之一［５，６］，因此，加速清除體內過多的自由基顯得尤為重要［７］。本文采用超聲波輔助手段提取了火炭母中的有效成分，并對提取工藝進行了優化，采用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋體系法和鄰苯三酚體系法對提取物的抗氧化活性進行了研究，旨在為進一步研究火炭母的理化作用提供依據，以便人們對火炭母這一傳統藥材有更充分的認識，從而使其開發利用更加科學合理。

１材料與方法

１．１儀器與試劑

火炭母全草采集于柳州市郊，清洗去泥，晾曬２ ｄ后置入烘箱中烘干，用粉碎機粉碎，待用。甲醇、石油醚（６０－９０）、乙酸乙酯、ＰＢＳ緩沖溶液、０．７５ ｍｍｏｌ／ｍＬ鄰二氮菲溶液、０．７５ ｍｍｏｌ／ｍＬ硫酸亞鐵溶液、０．０１％ Ｈ２Ｏ２、維生素Ｃ標準溶液、０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ鄰苯三酚、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ等試劑均為分析純，所用水為去離子水。儀器主要有ＺＮ－５００Ａ中草藥粉碎機（長沙市中南制藥機械廠）、ＪＹ８８－１超聲波細胞破碎機（寧波新芝科器研究所）、ＲＥ－５２０旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）。

１．２方法

１．２．１維生素Ｃ對·ＯＨ清除率標準曲線的繪制在１０ ｍＬ具塞比色管中，依次加入1 ｍＬ ０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ鄰二氮菲溶液，２ ｍＬ ｐＨ值７．４的ＰＢＳ緩沖液，1 ｍＬ不同濃度的樣品液或維生素Ｃ標準溶液，充分混勻后，再加入1 ｍＬ ０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸亞鐵溶液，混勻后再加入1 ｍＬ ０．０１％ H2O2，３７ ℃溫育６０ ｍｉｎ，在波長５３６ ｎｍ處測定吸光度值，同時用1 ｍＬ的去離子水代替樣品液，作為損傷管；用 1 ｍＬ的去離子水代替Ｈ２Ｏ２，作為空白管。每個處理試樣均做３個平行，取平均值。通過以下公式計算出不同維生素Ｃ濃度的·ＯＨ清除率，并繪制標準曲線。

·ＯＨ清除率＝×１００％

１．２．２超氧陰離子的清除試驗根據吳慧平的方法［８］，鄰苯三酚在堿性條件下能發生自氧化，生成有色中間物（在４２０ ｎｍ處有最大吸收峰）和超氧陰離子（·Ｏ２－），超氧陰離子對自氧化又起催化作用，依據有色中間物生成量的多少，可判斷超氧陰離子生成量的多少［９］。具體測定方法是在１０ ｍＬ的比色管中分別加入４ ｍＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ值８．２），置于２５ ℃水浴中預熱２０ ｍｉｎ，然后分別加入２０、４０、６０、８０、１００ μｇ/ｍＬ的樣品液或維生素Ｃ溶液1 ｍＬ，再加入在２５ ℃預熱２０ ｍｉｎ的1 ｍＬ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ鄰苯三酚溶液（鄰苯三酚用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ配制），混勻后在２５℃水浴中反應４ ｍｉｎ，立即用２滴８ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ終止反應， 并在波長４２０ ｎｍ處測定吸光度值，以等體積１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ代替鄰苯三酚溶液為空白，調零；對照組為1 ｍＬ的維生素Ｃ溶液。每個處理試樣均做３個平行試驗， 取平均值，其中維生素Ｃ為陽性對照。按下式計算·Ｏ２－清除率［６］，并繪制標準曲線。

·Ｏ２－清除率＝×１００％

１．２．３火炭母有效成分的提取稱取火炭母粉末４０ ｇ，分別加入６００ ｍＬ甲醇，在２００ Ｗ超聲波細胞破碎機里處理４０ ｍｉｎ后回流提?。?ｈ，所得提取物經過脫色、過濾得提取液，并蒸發濃縮至５０ ｍＬ，從中取出1 ｍＬ，稀釋一定倍數，利用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋體系法測定其對羥自由基的清除作用，或者利用鄰苯三酚體系法測定其對超氧陰離子的清除作用，計算出清除率，并與維生素Ｃ標準曲線比較，計算出稀釋液中與維生素Ｃ相當的濃度，再根據稀釋倍數計算得出總提取液中與維生素Ｃ相當的物質含量。

１．２．４火炭母有效成分的提取條件優化試驗對火炭母有效成分的提取條件分別進行了比較，①提取方法對火炭母有效成分提取效果影響因素有直接浸泡、超聲波輔助浸泡、微波輔助浸泡３種方法；②在超聲波功率設置為２００ Ｗ的前提下，比較了超聲波時間對火炭母有效成分提取效果的影響，處理時間分別為２０、４０、６０、８０ ｍｉｎ；③對火炭母有效成分提取效果影響的溶劑分別為甲醇、水、乙酸乙酯、石油醚；④甲醇濃度（甲醇∶水，體積比）對火炭母有效成分提取效果影響的配比選擇分別是

１∶２、１∶１、２∶１、５∶１、１∶０。

２結果與分析

２．１維生素Ｃ對·ＯＨ清除率的標準曲線

根據測定結果繪制維生素Ｃ對·ＯＨ清除率的標準曲線，結果見圖１，從圖１可見，清除率與維生素Ｃ濃度有很好的線性關系，相關系數為０．９９８ ４。

２．２維生素Ｃ對·Ｏ２－清除率的標準曲線

由測定結果繪制維生素Ｃ對·Ｏ２－清除率的標準曲線，結果維生素Ｃ濃度在０～１００ μｇ／ｍＬ 范圍內，與清除率有良好的線性關系，其線性方程為ｙ＝０．００２ １ｘ＋０．００３ ５，相關系數為０．９９１ １，可以作為標準曲線對火炭母提取液中的抗氧化效果進行測定。

２．３條件優化

２．３．１提取方法對火炭母有效成分提取效果的影響試驗考察了直接浸泡、微波輔助浸泡、超聲波輔助浸泡３種方法對火炭母有效成分提取效果的影響，結果見表１，由表１可知，在超聲波輔助的前提下，提取液對·ＯＨ－的清除率較其他兩種方法要高。

２．３．２超聲波時間對火炭母有效成分提取效果的影響在超聲波功率設置為２００ Ｗ的前提下，分別進行超聲波處理２０、４０、６０、８０ ｍｉｎ，以比較超聲波時間對火炭母有效成分提取效果的影響，結果見表２，從表２結果可見，當超聲波處理時間為４０ ｍｉｎ時，對火炭母有效成分提取的效果最佳。

２．３．３溶劑種類對火炭母有效成分提取效果的影響試驗分別用甲醇、水、乙酸乙酯和石油醚４種溶劑對火炭母有效成分進行了提取，比較它們的提取液對·ＯＨ－的清除情況，結果見表３。從表３可見，火炭母甲醇提取液對·ＯＨ－的清除率最高，是提取火炭母抗氧化有效成分的理想溶劑。

２．３．４甲醇濃度對火炭母有效成分提取效果的影響甲醇濃度（甲醇∶水，體積比）對火炭母有效成分提取效果影響的測定結果見表４，由表４可知，不同濃度甲醇對提取液的抗氧化性能影響較大，當甲醇∶水為１∶１時，提取液對·ＯＨ－的清除效果最好。

２．４提取液對超氧陰離子的清除率

綜合前述優化條件，采用超聲波處理４０ ｍｉｎ、甲醇∶水為１∶１、提取液體積為６００ ｍＬ、回流２ ｈ時的火炭母提取液，對·Ｏ２－進行清除率測定，結果見表５，由表５可知，火炭母提取液對·Ｏ２－有較強的清除作用，通過計算得出當火炭母原料為４０ ｇ、提取液濃縮至５０ ｍＬ時，總提取液對超氧陰離子的清除效果與９．８２ ｇ維生素Ｃ的效果相當。

３小結與討論

試驗采用超聲波輔助手段方法對火炭母中抗氧化成分進行了提取，用Ｈ２Ｏ２/Ｆｅ２＋體系法和鄰苯三酚體系法對提取液中的有效成分進行了測定，所得結果顯示，火炭母甲醇提取液具有較強的抗氧化作用，可以為火炭母制劑臨床用藥及保健用藥提供參考。

參考文獻：

［１］ 國家中醫藥管理局． 中華本草（第二卷）［Ｍ］． 上海： 上?？茖W技術出版社，１９９９．６４７－６４９．

［２］ 徐國鈞，何宏賢． 中國藥材學（下冊）［Ｍ］． 北京： 中國醫藥科技出版社，１９９６．１３７１．

［３］ 謝賢強，吳萍，林立東，等． 火炭母化學成分的研究［Ｊ］． 熱帶亞熱帶植物學報，２００７，１５（５）：４５０－４５４．

［４］ 朱華，高雅，張可鋒，等． 不同產地火炭母中槲皮素的含量測定方法研究［Ｊ］． 中藥新藥與臨床藥理，２００９，２０（６）：５５７－５５９．

［５］ 梁清濤，李琦，張宗德，等． 肺結核患者氧化／抗氧化失衡的初步研究［Ｊ］． 結核病與胸部腫瘤，２００８（１）：２５－２９．

［６］ 修曉娜，史遠剛，關偉軍，等． 自由基與人類衰老［Ｊ］． 中華現代中醫學雜志，２００８，４（２）： １０８－１１２．

［７］ 徐振華，劉忠玲． 自由基清除劑及其對延緩衰老的影響［Ｊ］． 中外醫學研究，２０１０，８（５）：７７－７８．

［８］ 吳慧平． 當歸不同炮制品清除自由基和抗脂質過氧化作用［Ｊ］． 中國中藥雜志，１９９６，２１（１０）： ５９９．

［９］ 宋琳琳，冉軍艦，張曉娜． 金銀花中總黃酮抗氧化性的研究［Ｊ］． 現代農業科學，２００９，９（１６）：１－２．

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