三種小麥蛋白質測定方法的比較

摘要：為比較不同小麥蛋白質測定方法，總結各方法的特點和適用條件，該試驗用凱氏定氮法、近紅外透射光譜分析法和考馬斯亮藍染色法分別對１４個小麥品種進行蛋白質含量的測定。結果顯示，三種方法都能測定出各材料的蛋白質含量，在９５％置信區間，凱氏定氮法和近紅外透射光譜分析法測定值與常年平均值之間存在線性關系，三者測定結果之間沒有顯著差異。

關鍵詞：凱氏定氮法；近紅外透射光譜分析法；考馬斯亮藍染色；蛋白質；測定

中圖分類號：Ｓ５１２．１；Ｓ３３１文獻標志碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2533-03

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ 3 Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｗａｒｄｓ Pｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｗｈｅａｔ

ＪＩ Ｙｕ－ｍｅｉ

（Ｈｅｂｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｅｂｉ ４５８０３０， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔhe ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｋｊｅｌｄａｈｌ， nｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ＮＩＴＳ） ａｎｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ 14 kinds of ｗｈｅａｔ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｆｅａｓｉｂｌｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｎｎｕａｌ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ａｎｄ ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ was linear． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Kｊｅｌｄａｈｌ； ＮＩＴＳ； Cｏｏｍａｓｓｉｅ bｒｉｌｌｉａｎｔ bｌｕｅ； ｐｒｏｔｅｉｎ； ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

小麥作為重要的農作物，其品質差異可顯著影響其經濟價值。蛋白質含量是衡量小麥加工品質的重要指標，通常采用具有較高準確度和精密度的用凱氏定氮法來測定［１－２］，但該法費時費工，其使用的試劑為強酸強堿，對環境污染較大［３－４］。近年來，近紅外透射光譜技術已廣泛應用于谷物子粒的品質分析和育種篩選［５－６］，例如：瑞典Ｐｅｒｔｅｎ公司的ＤＡ７２００近紅外儀能在天然物理狀態下，對谷物實現快速無損地定性定量分析［７］；考馬斯亮藍染色法是經典的蛋白質測定方法，通過測定５９５ ｎｍ處光吸收的增加量來計算與染料結合的蛋白質量，具有反應快、靈敏度高的優點［８］。本試驗通過分析比較凱氏定氮法、近紅外透射光譜分析法和考馬斯亮藍染色法測定小麥中的蛋白質含量，確定各種方法的適用條件，為探索小麥育種早期材料的蛋白質測定提供有效分析方法。

１材料和方法

１．１材料

選擇蛋白質含量差異分布較大的１４個小麥品種，包括：輪選９８７、輪選３２６、輪選２０９、輪選９７９、新１１試管株、新麥１１、豫麥４７、豫麥３４、羅夫林、楊麥１３、楊麥００１－１８、周麥１６、百農３２１７和百農矮抗５８。

本實驗所用試劑均為分析純試劑，實驗用水為去離子水。

凱氏定氮法使用試劑包括：硫酸鉀、硫酸銅、硫酸、２０ ｇ／Ｌ硼酸溶液、４００ ｇ／Ｌ氫氧化鈉溶液，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ標準溶液，１ ｇ／Ｌ甲基紅乙醇溶液，１ ｇ／Ｌ亞甲基藍乙醇溶液和１ ｇ／Ｌ溴甲酚綠乙醇溶液。臨用前配制２份甲基紅乙醇溶液與１份亞甲基藍乙醇溶液混合指示液。

考馬斯亮藍溶液：稱?。埃保?ｇ考馬斯亮藍Ｇ２５０，溶于５０ ｍＬ ９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇后，加入１００ ｍＬ ８５％（Ｖ／Ｖ）磷酸，并用去離子水稀釋至１ ０００ ｍＬ，濾紙過濾，待用。２０ ｇ／Ｌ氯化鈉溶液，５ ｇ／Ｌ氫氧化鈉溶液，７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇溶液。

１．２方法

所有材料種植在本單位試驗田，正常收獲、測產、脫粒和保存，采用四分法選取各品種的實驗材料。每個樣品設平行樣３個，結果取平均值計算。通過ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７．０軟件進行相關性分析。

１．２．１凱氏定氮法測定蛋白質含量稱取充分混勻的試樣０．５ ｇ，精確至０．００１ ｇ，移入干燥的２５０ ｍＬ定氮瓶中，加入０．２ ｇ硫酸銅、６.0 ｇ硫酸鉀及２０ ｍＬ硫酸，加熱后，炭化全部內容物，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱０．５ ～１ ｈ。取下放冷，小心加入２０ ｍＬ水。移入１００ ｍＬ容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，混勻備用，同時設置空白對照。再向水蒸氣發生器內加水至２／３處，加入數粒玻璃珠、甲基紅乙醇溶液數滴后，加熱煮沸并保持沸騰。并在接收瓶內加入１０．０ ｍＬ硼酸溶液及１～２滴混合指示液，使冷凝管的下端插入液面下。分別吸?。玻?ｍＬ試樣處理液和10 ｍＬ水注入反應室，隨后塞緊棒狀玻塞。緩慢滴加１０．０ ｍＬ氫氧化鈉于反應室中，蒸餾 １０ ｍｉｎ后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾 １ ｍｉｎ。冷卻后，取下蒸餾液接收瓶。以鹽酸標準溶液滴定至終點。同時作試劑空白。

按照下式計算蛋白質含量：

Ｘ＝×Ｆ×１００

Ｘ——試樣中蛋白質的含量（單位：ｇ／１００ ｇ）；

V1——試液消耗鹽酸標準滴定液的體積（單位：ｍＬ）；

V2——試劑空白消耗鹽酸標準滴定液的體積（單位：ｍＬ）；

V3——吸取消化液的體積（單位：ｍＬ）；

ｃ——鹽酸標準滴定溶液濃度（單位：ｍｏｌ／Ｌ）；

０．０１４ ０——１．０ ｍＬ １．０００ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸標準溶液相當的氮的質量（單位：ｇ）；

ｍ——小麥粉的質量，（單位：ｇ）；

Ｆ——小麥的蛋白質含量換算系數５．７０

１．２．２ＤＡ７２００近紅外分析儀測定蛋白質含量利用瑞士Ｐｅｒｔｅｎ公司生產的ＤＡ７２００近紅外儀測定，小麥近紅外校準曲線由中國農業部谷物品質監督檢驗測試中心建模，結果由系統軟件自動分析。

１．２．３考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量?。埃?ｇ小麥粉于研缽中，加少許二氧化硅研磨，?。?ｍＬ水分兩次洗研缽后轉入１０ ｍＬ離心管中。超聲振蕩１０ ｍｉｎ后，１２ ０００ ｒｐｍ離心１０ ｍｉｎ，取上清液于另一試管中，沉淀重復用水超聲提取，離心后，合并上清。?。埃?ｍＬ提取液，加入０．９ ｍＬ水和５ ｍＬ考馬斯亮藍Ｇ２５０，染色３ ｍｉｎ后在５９５ ｎｍ處測吸光值。另取取６支１０ ｍＬ干凈的具塞試管，按表１制備梯度濃度的標準溶液，加考馬斯亮藍Ｇ２５０顯色３ ｍｉｎ后，同條件測定其ＯＤ５９５ ｎｍ，制備標準曲線。根據標準曲線計算小麥樣品中的蛋白質含量。

２結果與分析

表２為１４個樣品常年平均值（前５個為測試樣品，沒有常年平均值）和三種方法測定蛋白質含量結果，表３、表４為在９５％置信區間時三種測定方法與常年平均值相關性的比較。

上述結果表明，三種蛋白質測定方法都能測定出小麥中的蛋白質含量。從表３可知，凱氏定氮法和近紅外光譜分析法在９５％置信區間顯著性系數都小于０．０５，表明兩種方法與常年平均值之間存在線性關系。從表４可知，凱氏定氮法和近紅外光譜分析法在Ｔ檢驗結果中，顯著性概率大于０．０５，這說明兩種方法測定的蛋白質含量與常年平均值之間不存在顯著性差異，可以真實的體現出被測樣品的蛋白質水平。但另一方面，考馬斯亮藍染色法的測定值與常年平均值之間相關性不強，這可能是操作誤差引起的，也可能是與該參考值的測定方法不同所導致，還可能是考馬斯亮藍染色法僅對微量蛋白測定羅為準確有關［９］。

３討論

凱氏定氮法測試結果雖然準確可靠，但該法所需儀器多為特制玻璃儀器，蒸餾與吸收裝置復雜，易破損，難操作和維護［１０］，而且整個過程耗時約７～８ ｈ，操作繁瑣，試劑消耗量大且排放物污染環境。特別是該方法測定后，樣品無法回收，因此，該方法并不適合于分析較為珍貴的樣品。采用近紅外光譜分析法分析樣品的耗時為１０～２０ ｍｉｎ，分析效率高，適用的樣品范圍廣，樣品勿需處理、３０～４０ ｇ種子即可用于分析，分析成本低，測試重現性好，屬于無損檢測，非常適合于育種過程中的早代種子鑒定和篩選大量中間材料［１１－１２］?？捡R斯亮藍染色法快速、靈敏，但只對微量蛋白有較好的測定線性范圍，因此在實驗前應將樣品的蛋白濃度稀釋為０．１～１．０ ｍｇ／ｍＬ，而且實驗必須在１ ｈ內完成，否則測試結果不準確［１３］。

總之，通過分析上述３種蛋白質的測定方法的原理和特點，并結合本實驗的分析結果，對實際樣品分析方法的選擇和應用分析具有重要的指導意義。

參考文獻：

［１］ 陳智慧，史梅，王秋香，等． 用凱氏定氮法測定食品中的蛋白質含量［Ｊ］．新疆畜牧業，２００８（５）：２２－２４．

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［９］ 李寧． 幾種蛋白質測定方法的比較［Ｊ］． 山西農業大學學報（自然科學版），２００６，２６（２）：１３２－１３４．

［１０］ 王雅． 蛋白質測定實驗的研究［Ｊ］． 實驗室研究與探索，２００５，２４（４）：５８－５９．

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［１２］ 李冬梅，田紀春． 小麥面粉蛋白質含量測定方法的比較［Ｊ］． 湖北農業科學，２００９（３）：７１５－７１７．

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