季也蒙畢赤酵母ypy17產脂肪酶條件的優化

摘要：從海南洋浦近海岸分離到１株產脂肪酶的酵母菌株，經鑒定為季也蒙畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ），利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計對發酵條件進行了篩選。結果表明，橄欖油、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４濃度對脂肪酶生產具有顯著的影響；利用響應面法對３個因子進行了優化，獲得了最佳發酵條件為橄欖油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸銨 １０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值７．３0，２８ ℃培養７２ ｈ，脂肪酶活力達到１８．２0 Ｕ／ｍＬ。

關鍵詞：季也蒙畢赤酵母；脂肪酶；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計；響應面法

中圖分類號：Ｑ９３９．９７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）12－2432-03

Condition Optimization of Lipase Production from Pichia guilliermondii ypy17

ＬＩ Ｘｉａｏ－ｙｕ１，２，ＬＵＯ Ｙａｎ－ｐｉｎｇ１，２，ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｑｉａｎｇ１，２，ＱＩＵ Ｂｏ２

（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７， Ｈａｉｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ｙｐｙ１７ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏａｓｔａｌ ｗａｔｅｒ ｏｆ Ｙａｎｇｐｕ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ． Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ） ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ａｎｄ Ｋ２ＨＰＯ４ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ influencing ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ３１．５７ ｇ／Ｌ， （ＮＨ４）２ＳＯ４ １０.00 ｇ／Ｌ， ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．３0． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １８．２0 Ｕ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ； ｌｉｐａｓｅ； Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ

脂肪酶是指可以催化三脂酰甘油水解產生甘油和游離脂肪酸或催化甘油與長鏈脂肪酸合成酯的酶［１］。脂肪酶廣泛存在于自然界中，但是僅僅微生物產生的脂肪酶具有生產應用價值，因為微生物產生的脂肪酶產量高，而且功能多樣，在油脂水解、食品加工、化妝品、醫藥、化工等工業領域中具有廣泛的應用，已成為繼蛋白酶、淀粉酶之后躍居世界工業酶制劑市場銷量第三位的酶種，具有良好的發展和應用前景［１］。許多微生物都可以產生脂肪酶，在陸地酵母中，現已發現褶皺假絲酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、熱帶假絲酵母（Ｃ． ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、大西洋假絲酵母（Ｃ． ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、柱狀假絲酵母（Ｃ． ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、近平滑假絲酵母（Ｃ． ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、粗狀假絲酵母（Ｃ． ｖａｌｉｄａ）、解脂耶羅維亞酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、粘紅酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、墨西哥畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｍａｘｉｃａｎａ）、森林畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、木糖畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、博丁尼畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）等［２］。目前用于工業生產脂肪酶的酵母菌主要有褶皺假絲酵母（Ｃ． ｒｕｇｏｓａ）和大西洋假絲酵母（Ｃ． ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）［２］。然而，對于來自于海洋的酵母生產脂肪酶的研究較少。研究以從海南洋浦近海分離到1株產脂肪酶的酵母菌（鑒定為季也蒙畢赤酵母）為材料，利用響應面法對其產脂肪酶的條件進行了優化，現將結果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株季也蒙畢赤酵母ｙｐｙ１７，由海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室自從海南洋浦近海分離并鑒定保存。

１．１．２培養基種子培養基：蛋白胨２０.00 ｇ／Ｌ，酵母粉１０.00 ｇ／Ｌ，葡萄糖２０.00 ｇ／Ｌ。發酵培養基：橄欖油１０.00 ｇ／Ｌ，硫酸銨１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５0 ｇ／Ｌ，ｐＨ 值７．０。

１．２方法

１．２．１脂肪酶活力測定新鮮菌種接種種子液，２８ ℃培養２４ ｈ，以４％接種量接入發酵培養基，２８ ℃培養７２ ｈ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心發酵液，取上清液測定脂肪酶活力。脂肪酶的活力測定采用ｐ-ＮＰ法［３］。酶活力單位（Ｕ）定義為每分鐘釋放出1 μｍｏｌ對硝基酚（ｐ-ＮＰ）的酶量。

１．２．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計使用Ｄｅｓｉｇｎ ｅｘｐｅｒｔ ７．０軟件，選用１１因素、試驗次數為１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計，考查各因素對產酶影響的顯著性。

１．２．３響應面分析根據響應面法中心組合設計（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ，ＣＣＤ）原理，對選取的顯著因子從５個水平進行考查，以確定最優條件。

２結果與分析

２．１Ｐｌａｃｋｅｔｔ-Ｂｕｒｍａｎ設計

選用試驗次數ｎ＝１２的試驗設計，對１１個因素（６個實際因素，５個虛擬因素）進行考查，響應值為酶產量。６個實際因素分別從兩個水平（－１，＋１）來考查，試驗設計見表１，各因素效應結果見表２。從表２可以看出，橄欖油濃度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４濃度３個因子的影響是顯著的，因此對這３個顯著因子進一步優化。

２．２響應面優化

對于Ｐｌａｃｋｅｔｔ-Ｂｕｒｍａｎ設計選擇的３個顯著因子（橄欖油濃度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４濃度），從５個水平（－α，－１，０，１，α）進行考查（表３），共進行２０組試驗，每組試驗均測定酶產量，試驗設計及每組試驗對應的酶產量見表４。

根據試驗結果，由軟件獲得擬合方程為：

＝－５１．５５＋０．２５ｘ１＋１４．４６ｘ２＋２４．１６ｘ３＋０．０９ｘ１ｘ２＋０．１９ｘ１ｘ３－２．６１ｘ２ｘ３－０．０２ｘ１２－０．９７ｘ２２－４．７６ｘ３２

其中，ｙ表示脂肪酶產量，ｘ１表示橄欖油濃度（ｇ／Ｌ），ｘ２表示初始ｐＨ值，ｘ３表示Ｋ２ＨＰＯ４濃度（ｇ／Ｌ）。擬合方程的決定系數Ｒ２＝０．９８０ ０，說明該方程能夠較好地模擬該菌株脂肪酶的發酵過程。

２．３響應面分析

對表４的試驗結果做響應面曲線見圖１和圖２。圖１表示Ｋ２ＨＰＯ４濃度為１.00 ｇ／Ｌ時，橄欖油濃度和初始ｐＨ值對酶產量的影響。從圖１可以看出，橄欖油濃度較初始ｐＨ值對脂肪酶產量的影響更為顯著，當橄欖油濃度在２８.00～３２.00 ｇ／Ｌ之間時，酶產量相對較高，橄欖油濃度大于３５.00 ｇ／Ｌ或小于２５.00 ｇ／Ｌ時，酶產量下降較快。圖２表示橄欖油濃度為３０．０0 ｇ／Ｌ時，初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４濃度對酶產量的影響。從圖２可以看出，初始ｐＨ值小于７．０0，Ｋ２ＨＰＯ４濃度小于１．００ ｇ／Ｌ時，脂肪酶產量下降得很快。根據軟件預測，當橄欖油濃度為３１．５７ ｇ／Ｌ、初始ｐＨ值為７．３0、Ｋ２ＨＰＯ４濃度為１．１６ ｇ／Ｌ時，脂肪酶活力最高，為１８．９０ Ｕ／ｍＬ。

２．４驗證試驗

按照優化后的產酶條件：橄欖油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸銨１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值為７．３0，２８ ℃培養７２ ｈ，試驗測得酶活力為１８．２０ Ｕ／ｍＬ，與預測值１８．９０ Ｕ／ｍＬ比較接近，說明該試驗設計與響應面分析方法能夠較好地模擬該脂肪酶實際的生產過程，結果可靠。

３小結與討論

Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計和響應面法具有簡易、迅速、可靠等優點，能快速有效地從眾多影響因素中篩選出重要因素并實現其水平優化［４］。響應面法已經被成功應用到許多微生物脂肪酶發酵過程優化當中，于瓊等［５］利用響應面法對一株假單胞菌產低溫脂肪酶的發酵條件進行了優化；鄭美玲等［６］利用響應面法對一株假絲酵母產脂肪酶的培養條件進行了優化，響應面設計選取了酵母膏、橄欖油和初始ｐＨ值３個因子，優化了培養基配方；岳珂等［７］對一株解脂假絲酵母產脂肪酶的發酵條件進行了優化，Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計篩選出３個顯著因素為蛋白胨、ＫＨ２ＰＯ４和初始ｐＨ值，采用響應面分析法確定了其最優發酵條件。

試驗結果表明，利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設計對一株季也蒙畢赤酵母產脂肪酶的發酵條件進行篩選，篩選出３個顯著因素，即橄欖油濃度、初始ｐＨ值和Ｋ２ＨＰＯ４濃度。利用響應面法對３個顯著因子進行了優化，建立了脂肪酶產量與３個因子間的數學模型，通過響應面圖分析及軟件預測，優化了發酵條件為橄欖油３１．５７ ｇ／Ｌ，硫酸銨１０.00 ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ３０.00 ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．１６ ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值為７．３0，２８ ℃培養７２ ｈ，脂肪酶的實測活力達到１８．２０ Ｕ／ｍＬ。

參考文獻：

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