塞拉菌素制劑的豚鼠最大化試驗和Buehler試驗

摘要：為檢驗塞拉菌素制劑對皮膚的過敏性，以化學藥物指導原則為指導，進行了豚鼠最大化試驗（ＧＰＭＴ）和Ｂｕｅｈｌｅｒ豚鼠封閉斑貼試驗（ＢＴ）。用２，４－二硝基氯苯溶液作為陽性對照物，在ＧＰＭＴ試驗和ＢＴ試驗的陽性對照組的致敏率分別為８０％和７０％，對豚鼠的致敏率較高，２個試驗受試物組的致敏率均為０，表明塞拉菌素對豚鼠沒有致敏性。

關鍵詞：塞拉菌素；豚鼠；斑貼試驗；最大化試驗

中圖分類號：Ｒ９７８．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）08－1650-03

Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ Ｍａｘｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ

ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｙｕ，ＺＨＯＵ Ｘｕ－ｚｈｅｎｇ，ＬＩ Ｊｉｎ－ｓｈａｎ，ＬＩ Ｊｉａｎ－ｙｏｎｇ，ＬＩ Ｂｉｎｇ，ＮＩＵ Ｊｉａｎ－ｒｏｎｇ，

ＷＥＩ Ｘｉａｏ－ｊｕａｎ，ＹＡＮＧ Ｙａ－ｊｕｎ

（Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｍａｘｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ （ＧＰＭＴ） ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ ｔｅｓｔ （ＢＴ） ｆｏｒ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｈｉｃｈ ｕｓｅｄ ２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ＧＰＭＴ ｔｅｓｔ ａｎｄ ＢＴ ｔｅｓｔ ｗａｓ ８０％ ａｎｄ ７０％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； while ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ｚｅｒｏ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ｔｏ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ； gｕｉｎｅａ ｐｉｇ； Bｕｅｈｌｅｒ ｔｅｓｔ； maximination text

塞拉菌素是由基因重組的阿維鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）新菌株發酵而成的阿維菌素類抗生素，是一種兼具抗體內、體外寄生蟲雙重作用的新型廣譜抗寄生蟲藥［１］，對蜱、螨、蚤、虱、惡絲蟲、部分線蟲有驅殺效果［２－７］。該藥目前主要被開發為犬貓專用的透皮制劑，為研究該制劑的皮膚過敏性，試驗進行了豚鼠最大化試驗和封閉斑貼試驗。

１材料和方法

１．１供試藥品

塞拉菌素制劑，規格45mg∶0.75mL，購至浙江海正藥業股份有限公司；０．１％和１％的２，４－二硝基氯苯溶液（上海中秦化學試劑有限公司）。

１．２試驗動物

成年白色豚鼠，未孕雌性，體重２５０～３００ ｇ。每次給藥前２４ ｈ給豚鼠肩背部脫毛，面積為３ ｃｍ×３ ｃｍ。試驗完后稱量動物體重。

１．３試驗方法

１）預試驗。皮內注射試驗：隨機選取試驗動物１６只分為４組，每組４只，于每只豚鼠肩背部去毛區分４點一次性皮下給予不同劑量的塞拉菌素溶液，給藥點間距１．５ ｃｍ，給藥后２４ ｈ和４８ ｈ觀察注射點紅斑、水腫和潰爛情況。各試驗組注射劑量分別為０．２ ｍＬ、０．１ ｍＬ、０．０５ ｍＬ、０．０１ ｍＬ。選取注射點皮膚不產生潰爛的劑量為皮內注射劑量。

豚鼠封閉斑貼試驗：隨機選取試驗動物１６只分成４組，每組4只，于每只豚鼠肩背部去毛區一次性斑貼不同劑量的塞拉菌素溶液，封閉貼敷２４ ｈ，進行激發接觸。在去除受試物后的１２ ｈ內觀察動物去毛區皮膚紅斑水腫情況。各試驗組劑量分別為０．５ ｍＬ、０．２５ ｍＬ、０．１ ｍＬ、０．０５ ｍＬ。選取可產生輕度刺激性的劑量作為第一次斑貼劑量，選取不產生刺激性的最大劑量作為第二次斑貼劑量。斑貼試驗操作：用醫用凡士林涂皮，將藥物吸附在１ｃｍ×１ｃｍ的濾紙上貼敷于皮膚表面，用塑料薄膜（保鮮膜）覆蓋，最后用膠布將斑貼纏繞固定，松緊程度以不影響豚鼠活動又能固定斑貼為宜。

２）正式試驗。豚鼠最大化試驗（ＧＰＭＴ）：隨機選取４０只豚鼠，試驗組２０只，陽性對照組和陰性對照組各１０只。第0天，豚鼠皮內注射給藥進行誘導。第七天后皮膚斑貼給予藥物再次進行誘導，第２１天皮膚斑貼給予激發劑量２４ ｈ，在去除激發劑量２４ ｈ、４８ ｈ和７２ ｈ后觀察皮膚紅斑、水腫和其他異常反應，按表１對紅斑和水腫進行評分，按表２進行過敏反應強度評價。若結果難以判定，7 d后再次激發。陽性對照組用７０％乙醇配成溶液，皮內注射的藥物濃度為０．１％，劑量為０．１0 ｍＬ，第一次斑貼誘導濃度和第二次斑貼致敏濃度分別是１.0％和０．１％，劑量均為０．２ ｍＬ（見表3）。

Ｂｕｅｈｌｅｒ豚鼠封閉斑貼試驗（ＢＴ）：隨機選取４０只豚鼠，試驗組２０只，陽性對照組和陰性對照組各１０只。第０、７和１４天用封閉片局部給藥以誘導，第２８天在未給藥的肋腹部貼６ ｈ以局部激發。去除封閉片２４ ｈ、４８ ｈ和７２ ｈ后觀察皮膚紅斑、水腫和其他異常反應，按表１對紅斑和水腫進行評分，按表２進行過敏反應強度評價。若結果難以判定，7天后再次激發。陽性對照組用７０％乙醇配成溶液，誘導濃度和致敏濃度分別是１.0％和０．１％，劑量均為０．２ｍＬ（見表4）。

結果評價標準：

反應平均值＝

根據表２判斷過敏反應發生程度。

２試驗結果

２．１預試驗

皮內注射試驗測得第一次誘導劑量為０．０５ ｍＬ。

斑貼誘導劑量和斑貼激發劑量分別是０．２５ ｍＬ、０．０５ ｍＬ。

２．２正式試驗

試驗結果見表5，ＧＰＭＴ試驗中陽性對照組有８只豚鼠發生不同程度的紅斑、水腫，致敏率為８０％，故對豚鼠有高度的致敏性，在去除激發劑量后的４８ ｈ和７２ ｈ紅斑和水腫癥狀變輕。陰性對照組和試驗組均無紅斑和水腫出現，表明塞拉菌素的致敏率為０。

試驗結果見表6，ＢＴ試驗中陽性對照組有７只豚鼠發生不同程度的紅斑、水腫，致敏率為７０％，對豚鼠的致敏性較高，在去除激發劑量后的４８ ｈ和７２ ｈ紅斑和水腫癥狀變輕。陰性對照組和試驗組均無紅斑和水腫出現，表明塞拉菌素的致敏率為０。

３討論

豚鼠血清內含有豐富的補體，當豚鼠再次接觸致敏原時比其他動物更容易產生過敏反應，因此本試驗選用豚鼠作為試驗對象。

飼養環境會對豚鼠的生理代謝、免疫產生影響，甚至會對豚鼠產生應激，故試驗過程中嚴格控制飼養環境，室溫２５℃左右、濕度６０％左右，注意通風換氣，定期添加墊料，每天更換新鮮的飲水。由于豚鼠需要更多的纖維素食物和維生素，故每天額外定量飼喂白菜１００ ｇ／只、胡蘿卜５０ｇ／只，以保證豚鼠正常生長需求。

試驗結束后稱量動物體重均在４００～５００ ｇ，故該藥物以及該試驗不影響動物生長。

本試驗以《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性 研究技術指導原則》為指導［８］，經預試驗得出塞拉菌素制劑的致敏劑量和激發劑量，兩個劑量均大于臨床使用劑量６ ｍｇ／ｋｇ。此外，指導原則中對動物的保定未作詳細描述，在不影響動物正常活動的前提下，對給藥斑貼部位進行固定。GPMT和BT試驗過程中所有豚鼠精神狀態良好，飲食較好，活動正常，未出現不良反應，故受試物塞拉菌素制劑在注射量６ ｍｇ／ｋｇ條件下，對豚鼠沒有過敏性，為其在臨床上的安全使用奠定了理論基礎。

參考文獻：

［１］ ＢＲＵＣＥ Ｃ Ｉ， ＢＩＳＨＯＰ Ｂ Ｆ， ＥＶＡＮＳ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ｏｆ ａ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＵＫ－１２４，１１４－ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ Ｅｎｄｅｃｔｉｃｉｄｅ ｆｏｒ Ｄｏｇｓ ａｎｄ Ｃａｔｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｅｔｓ； Ａｐｒｉｌ １１－１３，１９９９； Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ，ＵＳＡ．

［２］ ＪＥＲＮＩＧＡＮ Ａ Ｄ， ＭＣＴＩＥＲ Ｔ Ｌ， ＣＨＩＥＦＦＯ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｉｃｋ （Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ ａｎｄ Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ） ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｄｏｇｓ ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， ２０００， ９１（３－４）： １３２－１３８．

［３］ ＫＵＲＴＤＥＤＥ． Ａ， ＫＡＲＡＥＲ． Ｚ， ＡＣＡＲ． Ａ． Ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｓｏｒｏｐｔｉｃ ａｎｄ ｓａｒｃｏｐｔｉｃ ｍｉｔｅ ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， ２００７，１８：１８－２２．

［４］ ＳＨＡＮＫＳ Ｄ Ｊ， ＧＡＵＴＩＥＲ Ｒ， ＣＴＩＥＲ Ｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ ｏｎ ｄｏｇｓ ａｎｄ ｃａｔｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ， ２００３， １５２： ２３４－２３７．

［５］ ＭＣＣＯＹ Ｃ， ＢＲＯＣＥ Ａ Ｂ， ＤＲＹＤＥＮ Ｍ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｆｌｅａ ｂｌｏｏｄ ｆｅｅｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃａｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｎｉｔｅｎｐｙｒａｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｐｉｃａｌ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ ｉｍｉｄａｃｌｏｐｒｉｄ， ｆｉｐｒｏｎｉｌ ａｎｄ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， ２００８， １５６： ２９３－３０１．

［６］ ＭＣＴＩＥＲ Ｔ Ｌ， ＳＨＡＮＫＳ Ｄ Ｊ， ＷＡＴＳＯＮ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅａｒｔｗｏｒｍ （Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｏｇｓ ａｎｄ ｃａｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２０００，９１（３－４）：２５９－２６８．

［７］ ＷＡＮＧ Ｔ， ＹＡＮＧ Ｇ Ｙ， ＹＡＮ Ｈ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｅｌａｍｅｃｔｉｎ， ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｍｅｂｅｎｄａｚｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ， Ｃｈｉｎａ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２００８，１５３（５）：１２１－１２５．

［8］ 《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》課題研究組.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則［Z］． 2005，5-7．