快速檢測牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量PCR技術建立及應用

摘要：以牛病毒性腹瀉病毒（ＢＶＤＶ）的保守基因序列為參考，設計、優化出一對特異的ＰＣＲ引物和一條ＴａｑＭａｎ熒光探針，建立一種快速定量檢測牛病毒性腹瀉病毒的實時熒光定量ＰＣＲ技術。該方法檢測靈敏度比ＲＴ－ＰＣＲ高１００倍，并且避免了常規ＰＣＲ電泳檢測所帶來的高污染率。因此，該方法具有快速、靈敏、特異、重復性好和能定量檢測等優點，適用于牛場ＢＶＤＶ感染的快速定量檢測和肉類食品進出口檢疫。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒；實時熒光定量ＰＣＲ；定量檢測

中圖分類號：Ｓ８５８．２３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）08－1640-04

Ｔｈｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Real-time Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｄｅｔｅｃｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ

ＧＵＯ Ｒｕｉ１，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ２，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ１，ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ１，ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１， ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ，Ｗｕｈａｎ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｕｂｅｉ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｗｕｈａｎ ４３００５０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ） ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＶＤＶ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ． Ｉｔ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅ ｄｉｓｉｇｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｃｏｎｖｓｅｖｅｄ ｇｅｎｅ． Cｏｍｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ １００ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ than ＲＴ－ＰＣＲ ｔｅｓｔ； ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ usually caused by ｏｔｈｅｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｅ ＦＱ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒａｐｉｄ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ； ａｎｄ thus ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ for ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＶＤＶ ｆｒｏｍ ｃａｔｔｌｅ’ｓ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｅａｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）； real-time ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（ＢＶＤＶ）引起的一種傳染病，可引起許多臨床癥狀和一些疾病，包括繁殖障礙、呼吸綜合征、先天性缺陷、腸炎、持續感染（ＰＩ）和黏膜病（ＭＤ）等，易感動物除牛以外，還包括駱駝、綿羊、山羊、豬、鹿及多種野生反芻動物［１］。該病毒呈世界性分布，廣泛分布于美國、澳大利亞、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和歐洲許多養牛發達國家，是危害養牛業的重要病原之一。研究發現，其感染宿主涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄動物。每年死于ＢＶＤＶ感染的牛不少于５００萬頭，占飼養牛總數的０．５％～１．０％。ＢＶＤＶ感染懷孕母畜，造成胎兒產生免疫耐受，進而發展為持續性感染病畜，多數持續性感染動物外觀健康，但生產性能下降，且成為重要的傳染源。

ＢＶＤＶ和豬瘟病毒（ＣＳＦＶ）同屬黃病毒科瘟病毒屬，基因組具有高度的同源性，能產生交叉免疫［２］。ＢＶＤＶ能感染豬，在全球廣泛分布，對于無ＣＳＦＶ的國家（澳大利亞、愛爾蘭、英國、丹麥），其豬群中ＢＶＤＶ抗體的陽性率在１．６％～４３．５％，而其他一些國家，陽性率更高。在我國，專家預測豬群中ＢＶＤＶ抗體的陽性率在５０％以上。ＢＶＤＶ在妊娠早期感染母豬，仔豬就會出現持續的ＢＶＤＶ感染，即胎兒通過胎盤感染，則仔豬形成免疫耐受，且持續性感染。仔豬形成的這種免疫耐受，可嚴重抑制ＣＳＦＶ活疫苗的免疫應答，導致豬群豬瘟野毒的感染，從而暴發豬瘟，對我國的養豬業造成了巨大的經濟損失。

鑒于ＢＶＤＶ對我國養殖業（主要是養牛業和養豬業）造成的危害，建立一種準確、簡便的ＢＶＤＶ病原檢測方法，制定建議規程，對促進我國的養殖業健康發展、減少因該病引起的經濟損失具有非常重要的意義［３，４］。實時熒光定量ＰＣＲ技術，是指在ＰＣＲ反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個ＰＣＲ進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［５］。該方法以其高靈敏度、高特異性、快速等優點在病原體的定性和定量檢測方面得到了廣泛應用。本試驗應用熒光定量ＰＣＲ技術對ＢＶＤＶ病原進行快速定量檢測，不但靈敏度比普通ＰＣＲ高，而且還避免了普通ＰＣＲ高污染率的缺點，因此，開展該方法的研究，將具有良好的應用前景［６－１０］。

１材料與方法

１．１材料

ＢＶＤＶ ＮＡＤＬ株、牛腎傳代細胞（ＭＤＢＫ）、ＤＨ５α感受態細胞為湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室保存；豬瘟兔化弱毒疫苗購自武漢中博生物制品公司；牛拭子樣品采集湖北省出現疑似牛病毒性腹瀉病的牛場；ＤＭＥＭ培養液、新生牛血清為ＧＩＢＣＯ公司產品；ＤＮＡ 凝膠純化試劑盒和質粒小提試劑盒購自上海生工生物工程服務有限公司；ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ質粒載體為Ｐｒｏｍｅｇａ公司產品；Ｔ４ ＤＮＡ連接酶為Ｐｒｏｍｅｇａ公司產品；ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產品。

１．2方法

1.2.1陽性模板DNA的制備

1）引物和探針序列。以ＢＶＤＶ的高度保守的５′端非編碼區作為擴增靶區，設計并合成了一對引物和一條ＴａｑＭａｎ探針。具體序列如下：

上游引物（Ｂ１）：５′－ＧＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴ

ＡＧＴ－３′；

下游引物（Ｂ２）：５′－ＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣ

ＡＧ－３′；

探針序列（Ｂ）：５′－ＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡ

ＴＧＣＣＡＣＧ－３′；

探針修飾：５′－ＦＡＭ；（９）ＤＴ－ＢＨＱ；３′－ＰＯ４

2）病毒培養。ＭＤＢＫ細胞經含１０％小牛血清和雙抗（青霉素１００ μｇ／ｍＬ、鏈霉素１００ μｇ／ｍＬ）的ＤＭＥＭ培養液培養，待細胞長成７０％單層時，接種病毒液，３７℃吸附１ ｈ，其間不時搖動使液面均勻地鋪在細胞上，然后加含２％小牛血清和雙抗的ＤＭＥＭ維持液，３７℃繼續培養，在細胞病變達８０％以上時收獲。

3）常規ＰＣＲ。通過對ＰＣＲ反應條件與試劑的優化，確定如下反應方案：反應總體積為２０ μＬ，其中１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２ μＬ，引物Ｂ１、Ｂ２各０．５ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０．５ μＬ，加去離子水至２０μＬ。ＰＣＲ 反應條件為：９４℃預變性，５ｍｉｎ；９４℃變性１ ｍｉｎ；４５℃退火３０ ｓ，擴增３５個循環；最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。

4）標準陽性模板的構建。用上述引物進行常規ＰＣＲ反應擴增ＢＶＤＶ陽性模板ＤＮＡ，ＰＣＲ產物回收純化后克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ載體中，構建重組質粒，將重組質粒轉化入ＤＨ５α感受態細胞內，進行白斑篩選，保存菌液，將菌液送上海生工生物工程服務有限公司進行測序。將測序結果與報道序列進行比對，從測序正確的菌液中大量提取質粒，質粒濃度用紫外分光光度計測定ＯＤ２６０nm值，根據阿弗加德羅常數將濃度轉換為拷貝數，－２０℃保存，使用前稀釋。

１．2.2實時熒光定量ＰＣＲ該反應總體積２０ μＬ，反應體系為：１０倍系列稀釋的標準品或待測樣品的ＤＮＡ ２ μＬ，１０×Bｕｆｆｅｒ ２ μＬ，Ｂ１、Ｂ２各１ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），熒光探針Ｂ ２ μＬ（１ μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰｓ ０．５ μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５μＬ，去離子水加至２０ μＬ體系。反應條件為：９５℃ １０ ｍｉｎ；９４℃ １０ ｓ，４５℃ ３０ ｓ，４０個循環；72℃，１０ ｍｉｎ，檢測熒光。

１．2.3ＢＶＤＶ實時熒光定量ＰＣＲ反應標準曲線的建立分別以經梯度濃度稀釋的質粒為模板進行熒光定量ＰＣＲ擴增，并利用隨機軟件進行分析，得到動力學曲線及標準曲線。

１．2.4ＢＶＤＶ實時熒光定量ＰＣＲ檢測方法的評價

1）敏感性。標準陽性模板經１０１～１０８倍梯度稀釋，進行熒光定量ＰＣＲ檢測，并與普通ＰＣＲ比較。

2）特異性。對標準陽性模板、豬瘟疫苗毒株、未接種病毒的ＭＤＢＫ細胞、去離子水進行熒光定量ＰＣＲ檢測。試驗結果經溶解曲線分析，驗證其特異性。

3）重復性。取４份不同滴度水平的ＢＶＤＶ樣品進行組間重復性熒光定量ＰＣＲ檢測，反應重復２次，驗證ＢＶＤＶ實時熒光定量ＰＣＲ的穩定性。

１．3臨床樣本檢測

取湖北武漢、京山、仙桃、黃岡等地奶牛場疑似ＢＶＤＶ的病料，進行常規ＰＣＲ、RTQ－ＰＣＲ檢測，以比較２種方法的靈敏度。

２結果與分析

２．１ＢＶＤＶ特異性片段的擴增結果

經２％瓊脂糖凝膠電泳，ＰＣＲ產物大小約為２９３ ｂｐ，與預期結果相符（圖１）。菌液送上海生工生物工程服務有限公司測序，與預期結果相符。

２．２標準曲線及RTQ－ＰＣＲ靈敏度

以１０倍系列稀釋的標準品（１０１～１０８拷貝／μＬ）為定量檢測模板，在ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ定量儀上檢測，得到動力學曲線圖２和標準曲線圖３。

在標準曲線的制作過程中，模板的起始數越低則Ｃｔ值越大（Ｃｔ值的定義是：每個管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數）。一般認為當Ｃｔ值在３５以上時，定量結果即被認為是不可靠的。圖２顯示，當標準質粒濃度≥１０拷貝／μＬ時，動力學曲線呈上升趨勢，因此，該方法檢測靈敏度為１０拷貝／μＬ（該檢測靈敏度為被檢樣品的質粒模板濃度，如換算為被檢樣品濃度應該是２．３５×１０3拷貝／ｍＬ，為了統一起見，以下檢測結果均為質粒濃度）。圖３顯示該方法定量檢測的線性范圍為１．０×１０-1～１．０×１０８拷貝／μＬ，相關系數r＝０．９９８ ０。

２．３特異性

如圖４顯示，對標準陽性模板有熒光顯示；豬瘟疫苗毒株、對去離子水和未接病毒的ＭＤＢＫ細胞無明顯熒光反應，表明RTQ－ＰＣＲ檢測方法具有良好特異性。

２．４重復性

圖５顯示擴增結果曲線形態基本吻合，證明該檢測體系具有很好的重復性。

２．５RTQ－ＰＣＲ與常規ＰＣＲ比較

把陽性模板的細胞培養物用DEPC處理的水做１０倍梯度稀釋，并進行RTQ－ＰＣＲ和常規ＰＣＲ檢查，得到表１結果顯示，RTQ－ＰＣＲ的檢查靈敏度高出常規ＰＣＲ １００倍。

２．６臨床樣品的檢測

對２０１０年采自湖北武漢、京山、仙桃、黃岡等地奶牛場犢牛拭子樣品，進行常規ＰＣＲ、RTQ－ＰＣＲ檢測。結果顯示在檢測的６６份樣品中，RTQ－ＰＣＲ檢測陽性４２份，陽性檢出率為６３．６％（４２／６６）；常規ＰＣＲ檢測陽性２８份，陽性檢出率為４２．４％（２８／６６），說明RTQ－ＰＣＲ比常規ＰＣＲ靈敏度高。

３討論

本研究在比較ＣＳＦＶ有關序列的基礎上設計了２對引物和中間標記的ＴａｑＭａｎ探針。經過引物篩選和反應條件的優化，建立了ＢＶＤＶ的快速定量檢測方法，該方法檢測靈敏度為１０３拷貝／μＬ，定量線性范圍為１．０×１０３～１．０×１０８拷貝／μＬ，具有很好的重復性。試驗結果顯示該方法檢測靈敏度比常規ＰＣＲ高１００倍。在臨床樣品的檢測中，對疫苗毒株、犢牛拭子樣品的檢測結果顯示該方法具有很好適應性。

總之，牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量ＰＣＲ檢測方法特異性強、重復性好、操作簡單快速，整個過程可在４ ｈ內完成［１１］。該方法具有其他方法無可比擬的優點，隨著時間的推移，將可能成為檢測牛病毒性腹瀉病毒的最理想的標準。

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