馬奶酒中抗單增李斯特氏菌細菌素產生菌的篩選及鑒定

摘要：從內蒙古傳統乳制品馬奶酒中分離出１４４株乳酸菌，通過雙層瓊脂平板擴散法篩選出具有明顯抑菌作用的菌株。在排除有機酸、Ｈ２Ｏ２等的干擾后，其中１株乳酸菌的發酵上清液對受試的單核細胞增生李斯特氏菌表現出明顯的抑制作用；進一步硫酸銨沉淀、透析及濃縮處理后，其抑菌活性顯著增強，說明其代謝產物中含有蛋白質類抑菌物質，可能是細菌素。經生理、生化試驗和形態學觀察，將該菌株鑒定為屎腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃoｍ）。

關鍵詞：馬奶酒；乳酸菌；細菌素；篩選；鑒定

中圖分類號：Ｓ８７９．１；ＴＳ２０１．３文獻標識碼： Ａ文章編號：0439－８114（２０11）08－1659-03

Screening for Anti-Listeria monocytogenes Bacteriocin-producing Lactic Acid

Bacteria from Koumiss

ＷＵ Ｊｉｎｇa，b，ＭＡＮＧ Ｌａｉa，ＨＥ Ｙｉｎ-ｆｅｎｇb

（a． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Inner Mongolia Agricultural University，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００１８， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： １４４ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｋｏｕｍｉｓｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｆｔｅｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ， ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＭＫＢ６３ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉ－Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｂｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ． Ａｆｔｅｒ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｏｕｌｄ ｌｏｓｔ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｋｏｕｍｉｓｓ； ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ； ｓｃｒｅｅｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

馬奶酒是一種以鮮馬奶為原料，經乳酸菌和酵母菌共同發酵而成的乳酸－酒精發酵乳飲料，它在我國草原游牧民族中有著悠久的歷史。能夠舒筋活血、驅寒通絡、排毒、消食健胃、促進新陳代謝、增強肝脾功能和提高人體免疫力［１－３］。馬奶酒所具有的醫療保健作用與其所含有的微生物菌群有著密切的關系。

乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＬＡＢ）是一類能從可發酵碳水化合物（主要是指葡萄糖）中生產大量乳酸的細菌的通稱［４］，它們廣泛存在于人和禽畜的腸道、食品、物料及少數臨床樣品中。乳酸菌代謝能夠產生有機酸、過氧化氫、雙乙酰和細菌素等多種抗菌物質。這些抗菌物質通過抑制腐敗菌和病原菌的生長而防止腐敗，現已被廣泛應用于食品加工、醫藥保健、飼料發酵及畜禽疾病防治等方面［５，６］。細菌素是在乳酸菌代謝過程中通過核糖體合成機制產生的，并分泌到環境中的一類對革蘭氏陽性菌具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽，主要抑制同源的細菌，產細菌素菌株自身對細菌素具有免疫性 ［７，８］。同時，細菌素以其無毒性、對熱穩定、易被人體消化道分泌的酶降解等特性，被公認為是具有潛在開發能力的天然食品防腐劑和飼料添加劑［９，１０］。目前已被分離獲得并實際應用的乳酸菌細菌素有雙球菌素、乳酸鏈球菌素、乳桿菌素等［１１］。

近年來，隨著分子生物學和生物技術的發展及國際上對食品安全問題的日益關注，開發乳酸菌素作為新型的天然食品防腐劑、飼料添加劑和醫藥用劑已成為研究熱點。因此，篩選出具有高活性的細菌素產生菌株具有重要的理論和實踐意義。本研究以內蒙古傳統發酵乳制品馬奶酒為材料，分離篩選具有抑菌作用的乳酸菌，在種的水平上對其進行鑒定，以期得到具有優良特性的細菌素產生菌。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１馬奶酒內蒙古地區牧民家庭中以傳統發酵法制作的馬奶酒樣品，樣品取回后于４℃貯藏備用。

１．１．２指示菌單核細胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）由內蒙古農業大學食品科學與工程學院實驗室提供。

１．１．３試劑培養基：ＭＲＳ固體、液體培養基，胰酪蛋白胨液體培養基［１２，１３］，乳酸菌鑒定用系列培養基［１４］，分別依文獻介紹的方法配置。胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶Ｋ、溶菌酶，購于北京Ａｍｅｒｓｃｏ公司。

１．２方法

１．２．１乳酸菌的分離與培養將采集的２５種樣品各取１ ｇ左右加入到９ ｍＬ無菌生理鹽水試管中，連續１０倍遞增稀釋，取１０－４、１０－５、１０－６稀釋度的混懸液１５０ μＬ，分別滴加到改良ＭＲＳ瓊脂培養基（含２．５％ ＣａＣＯ３）表面，用玻璃棒均勻涂抹，于３７℃培養４８ ｈ，觀察菌落形態是否有溶鈣圈。挑選有ＣａＣＯ３溶解圈的菌落劃線接種到改良ＭＲＳ瓊脂斜面。將４８ ｈ純培養菌落做革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株菌，４℃冰箱保存備用。

１．２．２乳酸菌上清液的制備用接種環挑取保存的乳酸菌接種于ＭＲＳ液體培養基中，３７℃ 靜置培養３６ ｈ，測定培養液的ｐＨ值，并取發酵液經８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ（４℃），取上清液用０．４５ μｍ濾菌器過濾滅菌，得無細胞發酵上清液，冰箱４℃保存備用。

１．２．３指示菌的活化培養及菌懸液的制備將保存的單核增生李斯特氏菌接入胰酪蛋白胨液體培養基，其余的指示菌均挑單菌落接入營養肉湯培養基中，３７℃培養箱中培養２０ ｈ后以２％的接種量再活化１代，用０．８５％無菌生理鹽水梯度稀釋，制成１０６ ＣＦＵ／ｍＬ菌懸液，冰箱中４℃保存待用。

１．２．４產抑菌物質乳酸菌的篩選

１）抑菌試驗方法。采用雙層瓊脂平板擴散法檢測待檢菌發酵上清液中是否含有抑菌物質。即在滅菌平皿內倒入１０ ｍＬ ２％的滅菌水瓊脂，待瓊脂冷卻后放入滅菌的牛津杯中，將０．１ ｍＬ含菌約１０６ ＣＦＵ／ｍＬ的指示菌懸液加入到２０ ｍＬ ５０℃的指示菌培養基中，混合培養，倒入平皿中。培養基凝固后，用無菌鑷子取出牛津杯，加０．２ ｍＬ乳酸菌上清液，室溫擴散３～５ｈ，３７℃ 培養１２～１８ ｈ，設３個重復，以未接菌的ＭＲＳ液體培養基作對照，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。選取抑菌活性高的菌株做復篩試驗。

２）排除有機酸的干擾。用１．０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液將發酵上清液調至ｐＨ值為６．０進行抑菌試驗，以相同ｐＨ值的乳酸和乙酸作為對照，排除有機酸的干擾。

３）排除過氧化氫的影響。將發酵上清液在８０℃保溫１０ ｍｉｎ來排除過氧化氫的干擾，采用雙層瓊脂平板擴散法檢測乳酸菌發酵上清液的抑菌活性。

１．２．５菌株產細菌素的鑒定

１）硫酸銨沉淀粗提。透析袋的處理方法：商品透析袋先用５０％乙醇煮沸１ ｈ，再依次用５０％ 乙醇、０．０１ ｍｏｌ／ｍＬ碳酸氫鈉和０．００１ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液洗滌，最后用去離子水沖洗即可使用。

對上步篩選得到的菌株進行產細菌素的鑒定試驗。將硫酸銨粉末緩慢加入５０ ｍＬ離心上清液中，邊加邊攪拌，使最終飽和度為６０％，可看到有絮狀沉淀出現，置于４℃冰箱中靜置沉淀過夜，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，４℃冷凍離心２０ ｍｉｎ，將沉淀物按１∶１０比例溶解于滅菌去離子水中，做抑菌試驗，同時以去離子水作為對照。然后將剩余的復溶液裝入３ ５００ Ｄａ的透析袋中脫鹽，用去離子水透析過夜，更換３次透析液，然后檢測鹽析上清液抑菌活性。

２）蛋白酶檢測抑菌物質的蛋白質性質。將不同蛋白酶配成５ ｍｇ／ｍＬ的溶液，各?。埃?ｍＬ于離心管中，分別無細胞上清液０．４ ｍＬ使酶的終濃度為１ ｍｇ／ｍＬ，其中胃蛋白酶和酸性蛋白酶發酵液的ｐＨ值調至２～３，其他蛋白酶發酵液的ｐＨ值均調至６～７（在其最適ｐＨ值范圍內），同時以０．１ ｍＬ緩沖液加入０．４ ｍＬ細菌素液作為對照，３７℃溫育４ ｈ，然后以單核細胞增生李斯特氏菌為指示菌，檢測抑菌活性。

１．２．６產細菌素乳酸菌菌株的鑒定將復篩得到的菌株進行菌落形態和生物學特性試驗，參照文獻方法鑒定［１５］。

２結果與分析

２．１乳酸菌的分離和產抑菌物質菌株的篩選

從內蒙古傳統乳制品馬奶酒中共分離出１４４株乳酸菌，其中球菌４５株，桿菌９９株。采用牛津杯雙層瓊脂法對單核增生李斯特氏菌進行抑菌試驗，得到有抑菌活性的菌株８株。

乳酸菌在生長過程中代謝可以產生許多具有抑菌作用的物質，如有機酸、細菌素、Ｈ２Ｏ２和雙乙酰等，均可分泌到上清液中起到抑制其他菌生長的作用，因此在篩選時就要排除這些干擾因素，確定是細菌素引起的抑菌作用。本研究將初篩菌株的發酵上清液用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液中和ｐＨ值至６．０，再進行對單核增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＣＭＣＣ５４００２）抑菌試驗，并設立ｐＨ值為６．０的乳酸和乙酸作對照。結果表明，ｐＨ 值為６．０的乳酸和乙酸對單核增生李斯特氏菌無抑制作用；在排除有機酸的干擾后和過氧化氫及菌體細胞的干擾試驗后，受試菌中只有３株乳酸菌對單核增生李斯特氏菌仍然保持一定的抑菌活性，這說明發酵上清液中還有其他抑菌活性物質的存在。其中有１株乳酸菌對單核增生李斯特氏菌表現出較好的抑菌作用，因此選定ＭＫＢ６３作為下一步試驗的測試菌。

２．２菌株產細菌素的鑒定

２．２．１硫酸銨沉淀粗提硫酸銨通常用于蛋白質的鹽析，一般細菌素在６０％飽和度時即大部分沉淀。透析袋處理通常用于蛋白質的脫鹽，可以使小分子鹽類物質（有機酸等）滲出袋外，從而達到純化蛋白的目的。本試驗對篩選得到的１株細菌素產生菌的發酵上清液進行硫酸銨鹽析和透析處理，發現抑菌活性仍然存在，而且抑菌活性顯著增強。其抑菌試驗結果見圖１。

２．２．２蛋白酶敏感性取少許胃蛋白酶、溶菌酶、胰蛋白酶和蛋白酶Ｋ酶溶液與發酵上清液混合，使酶濃度為０．５ ｍｇ／ｍＬ，于３７ ℃酶解４ ｈ，進行牛津杯抑菌試驗，結果見表２。從表２可以看出，受試的１株菌所產抑菌活性物質對蛋白酶表現出不同的敏感性，但是它們在經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，均完全失去抑菌活性，基本可以推測，該抑菌活性物質為一類蛋白質類。

２．３菌株的鑒定

菌株分離純化后，革蘭氏染色陽性，細胞呈球形或卵圓形，一般以雙球狀或鏈狀排列，菌體大小為（０．６～２．０）μｍ×（０．６～２．５）μｍ，不生芽孢，兼性厭氧。在ＭＲＳ固體培養基上３７℃培養２４ ｈ后，形成圓形光滑、乳白色、不透明的小菌落。乳酸菌的菌體形態如圖２所示。

菌株ＭＫＢ６３的生理生化試驗結果如表３所示。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，分離到的球菌發酵葡萄糖產酸不產氣，均產生Ｌ－乳酸。１０℃和４５℃生長，并生長于ｐＨ值為９．６的６．５％ ＮａＣｌ中，可還原０．１％美蘭牛乳，鑒定為Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ屬的細菌。菌株具有耐熱性，發酵甘露醇、蜜二糖，不發酵棉子糖、山梨醇，基本符合文獻資料中屎腸球菌的特征，初步確定為屎腸球菌（Ｅnterococcus ｆａｅｃoｍ）。

３結論

從傳統馬奶酒中分離出１４４株乳酸菌，其中有３株乳酸菌對單核細胞增生李斯特氏菌具有較強的抑制作用，通過對該菌株發酵上清液中有機酸和過氧化物的排除試驗和蛋白酶敏感性試驗，得到產細菌素較高的ＭＫＢ６３菌株。經常規生理生化試驗和形態學觀察，初步鑒定為屎腸球菌，這將為我國乳酸菌細菌素的開發與利用提供豐富的資源。課題組將進一步研究該細菌素的生物學特性及安全性，為其在食品保鮮防腐方面的應用打下基礎。

參考文獻：

［１］ 哈斯蘇榮，阿木古楞． 酸馬奶及其醫學價值［Ｊ］．中國中藥雜志，２００３，２８（１）：１１－１４．

［２］ 高學云，芒來． 發酵乳中功能性乳酸菌的研究進展［Ｊ］．內蒙古科技與經濟，２００７，（１７）：３９－４０．

［３］ 殷文政，馬玉玲．馬奶酒乳酸菌的分離及其生物學特性的研究［Ｊ］．食品與發酵工業，２００５，３１（９）：２９－３１．

［４］ 楊潔彬，郭興華，凌代文，等．乳酸菌－生物學基礎及應用［Ｍ］．北京：中國輕工業出版社，１９９６.

［５］ 賈樹彪，張穎舒，李盛賢，等．乳酸酸菜菌種的選育和生產工藝研究［Ｊ］．生物技術，２０００，１０（１０）：４７－５０．

［６］ ＣＬＥＶＥＬＡＮＤ Ｊ， ＭＯＮＴＶＩＬＬＥ Ｔ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ： ｓａｆｅ， ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ｆｏｒ ｆｏｏｄ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１， ７１： １－２０．

［７］ ＮＥＴＴＬＥＳ Ｃ Ｇ， ＢＡＲＥＦＯＯＴ Ｓ Ｆ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｏｆ ｆｏｏｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ， １９９３， ５０（４）： ３３８－３５６．

［８］ ＤＥＥＧＡＮ Ｌ Ｈ， ＣＯＴＴＥＲ Ｐ Ｄ， ＨＩＬＬ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏ－ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈｅｌｆ－ｌｉｆｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００６，１６： １０５８－１０７１．

［９］ 李鐵軍，李愛云，張曉峰．乳酸菌抗菌機理研究進展［Ｊ］．微生物學通報，２００２，２９（５）： ８１－８５．

［１０］ 田召芳，鐘相，常維山，等．乳酸菌細菌素的研究進展［Ｊ］．微生物學雜志，２００３，２３（６）：４７－４９．

［１１］ 張艾青， 劉書亮， 敖靈． 產廣譜細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［Ｊ］． 微生物學通報，２００７，３４（４）：７５３－７５６．

［１２］ 沈萍，秀容，廣武． 微生物學實驗［Ｍ］．第三版．北京：高等教育出版社，１９９９．１１１－１１３．

［１３］ 凌代文，東秀珠．乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［Ｍ］．北京：中國輕工業出版社，１９９９．８５．

［１４］ 小崎道雄，內村泰． 乳酸菌実験マニュアル［Ｍ］．東京：倉書店，１９９２．２９－７２．

［１５］ ＳＮＥＡＴＨ Ｐ Ｈ Ａ， ＭＡＩＲ Ｎ Ｓ， ＳＨＡＲＰＥ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｂｅｇｅｙｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ ２）［Ｍ］． Ｂａｌｔｉ－ｍｏｒｅ： Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， １９８６．７９７－８２２．