海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌對(duì)養(yǎng)殖海水COD的降解

摘要：直接用純種菌體在適當(dāng)條件下培養(yǎng)得到菌體，消除了生物菌體混入雜菌的影響。通過正交試驗(yàn)得出海藻酸鈉固定化鞘氨醇單細(xì)胞小球?qū)Γ茫希慕到獾淖罴褩l件；討論了時(shí)間、溫度、ｐＨ值、降解劑用量、搖床搖速幾個(gè)單因素對(duì)海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球降解ＣＯＤ的影響；通過比較可以得出在降解ＣＯＤ的過程中，微生物只有借助某一載體才能表現(xiàn)出其最佳降解活性，微生物包埋法具有操作簡(jiǎn)單，效果明顯，污染少，成本低等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：降解；海藻酸鈉；固定化；鞘氨醇單胞菌；ＣＯＤ

中圖分類號(hào)：Ｘ７１２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）10－1975-05

Study on the COD Degradation of Cultured Seawater in Liangyungang by Sodium Alginate Immobilized Sphingom onas

ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｂｉｎａ，ｂ，ＹＩＮ Ｌｅｉｂ，ＭＡ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇｂ，ＸＵ Ｘｉｎｇ－ｙｏｕｂ，ＫＯＮＧ Ｊｕｎｂ

（a． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； b．College ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Jiangsu， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｎｅｗ ｔｈａｌｌｉ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ immobilized Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ degradation ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ value， ｔｈｅ degradation reagent dosage ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈａｋｅｒ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ degradation ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎｌｙ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｈａｄ ｍａｎｙ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ， ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ， ｌｅｓｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ， ｌｏｗ ｃｏｓｔ， ｅｔｃ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ； ＣＯＤ

連云港近海海域污水、廢渣、廢油和化學(xué)物質(zhì)源源不斷地流入大海以及海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展使得海水水質(zhì)惡化，赤潮等海水變質(zhì)現(xiàn)象的發(fā)生讓社會(huì)認(rèn)識(shí)到海水修復(fù)技術(shù)的重要性。海水修復(fù)技術(shù)有物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù)法等［１］。化學(xué)修復(fù)法由于投加化學(xué)試劑，因此費(fèi)用高且易產(chǎn)生二次污染［２］。物理修復(fù)法易于操作，處理效果明顯，但往往治標(biāo)不治本［２］。微生物固定化修復(fù)技術(shù)的主要特點(diǎn)是對(duì)完整的微生物細(xì)胞進(jìn)行固定，可避免人為破壞生物酶的活性和生化反應(yīng)的穩(wěn)定性，可提高單位體積水體內(nèi)微生物細(xì)胞密度，并可加快細(xì)胞的流動(dòng)速率，能有效地解決污染環(huán)境修復(fù)問題［３］。固定化后的微生物能長(zhǎng)期保持活性，固定化顆粒可重復(fù)使用，節(jié)省投資，固定化細(xì)胞顆粒的微環(huán)境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對(duì)微生物體的惡性競(jìng)爭(zhēng)、吞噬和毒害，使其在復(fù)雜環(huán)境中和激烈的操作條件下可穩(wěn)定地發(fā)揮高效性能［４］。將固定化細(xì)胞顆粒直接投加到其中，操作簡(jiǎn)單，不產(chǎn)生二次污染，節(jié)省投資，簡(jiǎn)化流程［５］。而有關(guān)海水養(yǎng)殖環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)的研究，國(guó)內(nèi)外剛剛起步，微生物修復(fù)是當(dāng)前污染環(huán)境生物修復(fù)的主要形式。于偉君［６］等研究表明光合細(xì)菌能降低蝦池水中有害物質(zhì)、氨氮的含量，對(duì)改善蝦池生態(tài)環(huán)境有明顯的效果。莫照蘭等［７］在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選到對(duì)蝦池富營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物具有較高降解性能的細(xì)菌，包括弧屬、假單胞屬、發(fā)光桿菌屬等，試驗(yàn)結(jié)果表明這些細(xì)菌對(duì)消化蝦池殘餌、糞便的處理效果很明顯。研究從海洋底泥中篩選出的鞘氨醇單胞菌菌株ＲＢ２２５６使用海藻酸鈉固定后對(duì)污染的養(yǎng)殖海水進(jìn)行生物修復(fù)，對(duì)海水中的ＣＯＤ進(jìn)行降解，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出ＣＯＤ的最佳降解條件和各單因素對(duì)ＣＯＤ降解影響的大小，可為污染海水的生物修復(fù)提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

１材料與方法

１．１主要儀器與試劑

ＷＦＪ－７２００型可見分光光度計(jì)［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；ＴＤＬ－４飛鴿系列離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ＳＷ－ＣＪ－１Ｄ型無菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ｐＨSＪ－５型實(shí)驗(yàn)室ｐＨ計(jì)（上海樹立儀器儀表有限公司）；ＳＨＰ－１８０生化培養(yǎng)箱（上海雷磁儀器廠）；ＨＺＱ－ＱＸ型全溫振蕩器（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司）。

氯化鈣溶液：２０ ｍｇ／Ｌ，稱取２０ ｇ氯化鈣溶于水中，移入１ ０００ ｍＬ容量瓶?jī)?nèi)，稀釋至標(biāo)線，搖勻。

１．２海藻酸鈉固定化鞘氨醇單細(xì)胞小球的制備

試驗(yàn)以連云港贛榆縣某養(yǎng)殖場(chǎng)海水為樣品，此海水樣的初始ＣＯＤ濃度為２０．５0 ｍｇ／Ｌ。

１）配制２％（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）海藻酸鈉－鞘氨醇單胞菌混合液（１ ｇ海藻酸鈉加入５０ ｍＬ培養(yǎng)好的菌液）。

２）用注射器吸取海藻酸鈉－鞘氨醇單胞菌混合液，慢慢加入ＣａＣｌ２溶液中，老化４ ｈ。

３）傾去ＣａＣｌ２溶液，用去離子水洗滌海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球至少３次（以洗滌液中不含Ｃａ２＋為準(zhǔn)）。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)有溫度、小球質(zhì)量、ｐＨ值、時(shí)間４個(gè)因素，分別記為Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，每個(gè)因素設(shè)４個(gè)水平，采用４因素４水平的正交表將試驗(yàn)分為１６個(gè)處理組，其中Ａ１． ３７ ℃、Ａ２．３０ ℃、Ａ３．２０ ℃、Ａ４．１０ ℃；Ｂ１．０．９ ｇ、 Ｂ２．１．０ ｇ、 Ｂ３．１．１ ｇ、 Ｂ４． １．２ ｇ；Ｃ１． ｐＨ值４、Ｃ２． ｐＨ值５、Ｃ３． ｐＨ值６、Ｃ４． ｐＨ值７；Ｄ１． ９０ ｍｉｎ、Ｄ２．１００ ｍｉｎ、Ｄ３．１１０ ｍｉｎ、Ｄ４．１２０ ｍｉｎ，每處理３次重復(fù)。海水樣品為10 mL。

１．３．２單因素試驗(yàn)分別考察了溫度、小球質(zhì)量、ｐＨ值、時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球降解ＣＯＤ的影響。

１．３．３比較試驗(yàn)考察了鞘氨醇單胞菌包埋與否對(duì)ＣＯＤ降解的影響。

１．３．４試驗(yàn)步驟用所取海水水樣調(diào)節(jié)不同ｐＨ值，加入降解劑海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌小球，至上述Ａ因素中不同溫度的搖床中，振蕩Ｄ因素中的不同時(shí)間，待振蕩時(shí)間結(jié)束，過濾，測(cè)降解后海水中的ＣＯＤ。

２結(jié)果與分析

２．１正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由測(cè)得的降解后海水ＣＯＤ的值計(jì)算出降解劑的降解量和降解率，其數(shù)據(jù)見表１。由表１可以看出，降解量中極差最大的是Ｃ，其次是Ｄ、Ａ、Ｂ，說明ｐＨ值對(duì)降解量的影響最大；再得出降解率中的極差大小與降解量的順序一致，也是Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，說明ｐＨ值對(duì)降解率的影響最大。吸附率的方差分析如表２。由表２可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ對(duì)吸附率的影響極顯著，結(jié)合表１各因素對(duì)吸附率影響的主次順序?yàn)椋茫荆模荆粒荆拢瑒t最優(yōu)方案為Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ１，即在ｐＨ值為６，振蕩９０ ｍｉｎ，３７℃，小球質(zhì)量為０．９ ｇ時(shí)吸附效果最佳。吸附量的方差分析如表３。由表３可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ對(duì)吸附量的影響極顯著，結(jié)合表１各因素對(duì)吸附量影響的主次順序Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，則最優(yōu)方案為Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ４，即在ｐＨ值為６，振蕩９０ ｍｉｎ，３７℃，小球質(zhì)量１．２ ｇ時(shí)吸附效果最佳。

２．２ 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

２．２．１時(shí)間、溫度與降解量之間的關(guān)系試驗(yàn)中時(shí)間試驗(yàn)擬定靜置與振蕩兩種情況，取５個(gè)２５ ｍＬ錐形瓶向其中加１０ ｍＬ海水，再向其中加入１．０ ｇ降解劑，在３７℃水浴中不同時(shí)間測(cè)ＣＯＤ，其結(jié)果見圖１。從圖１中看出，兩種情況下以振蕩時(shí)降解效果最佳，主要是由于振蕩時(shí)整個(gè)溶液內(nèi)還原性物質(zhì)是均勻分布的，降解速度均勻；靜置時(shí)小球降解還原性物質(zhì)是呈局部狀態(tài)的，速度時(shí)快時(shí)慢。開始時(shí)降解速度較快，接下來降解速度相對(duì)變慢，到最后還出現(xiàn)降解量下降的現(xiàn)象。這主要是由于起初小球內(nèi)部積累的還原性物質(zhì)濃度較低，隨時(shí)間變化，小球內(nèi)部還原性物質(zhì)的濃度增大，使降解速率減小［８］，當(dāng)降解量達(dá)到最大后，小球內(nèi)部的還原性物質(zhì)被解析出來，降解量出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。由圖２可以看出，在相同的時(shí)間內(nèi)，溫度越高，降解量就越大，這主要是由于降解反應(yīng)是一個(gè)吸熱過程，溫度越高，越有利于降解的進(jìn)行。但是超過一定溫度后，降解效果變差，主要是由于微生物的活性是在一定溫度下表現(xiàn)出來的，超過或低于此溫度酶的活性降低，小球的降解率性能下降［９，１０］，降解效果達(dá)不到最佳。

２．２．２降解劑量、ｐＨ值對(duì)降解性能的影響由圖３可以看出，增加降解劑的量可以提高降解性能，但加入過多也會(huì)降低降解性能。原因是由于降解劑的解析作用；另一方面是由于降解體系中溶質(zhì)與溶劑相互作用，從而使降解性能下降［５］。

從圖４中可以看出，當(dāng)ｐＨ值為７左右時(shí)降解效果較佳。隨著ｐＨ值的增大，降解性能呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于在較強(qiáng)酸的條件下，Ｈ＋的濃度較大，結(jié)合了細(xì)菌表面的負(fù)電荷，使降解劑表面的負(fù)電荷減少，從而使其降解還原性物質(zhì)的能力減小，因此其降解性能也差。另外，微生物只有在最佳ｐＨ值下，其體內(nèi)的酶活性最大，ｐＨ值或高或低都會(huì)影響酶的活性，因此不在最佳ｐＨ值下時(shí)，酶的活性降低，降解性能也會(huì)下降［１１，１２］。

２．２．３搖床轉(zhuǎn)速、不同生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)菌對(duì)降解性能的影響由圖５看出，隨轉(zhuǎn)速增加，降解量和降解率先增加后減少，因?yàn)楦淖冝D(zhuǎn)速影響溶氧和水中微生物的接觸情況。低轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致供氧不足，限制微生物對(duì)還原性物質(zhì)的去除，使水與微生物不能充分接觸；提高轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致微生物之間的摩擦增加，造成微生物磨損，不易降解還原性物質(zhì)［１３］。

由圖６可知，培養(yǎng)２４ ｈ的微生物做成的小球的降解量與降解率最大。這是由于培養(yǎng)２４ ｈ的微生物正處于活性最強(qiáng)的對(duì)數(shù)期，而選用的其他培養(yǎng)時(shí)間的微生物處于微生物生長(zhǎng)繁殖的其他３個(gè)時(shí)期，其活性不如對(duì)數(shù)期，因此，選用培養(yǎng)２４ ｈ的微生物做成小球的降解量與降解率比選用其他培養(yǎng)時(shí)間的大［１０］。

由此可見，對(duì)ＣＯＤ降解起主要作用的還是微生物，海藻酸鈉作為一種天然高分子物質(zhì)具有生物降解性和生物相容性，由于其結(jié)構(gòu)中含有降解性官能團(tuán)，其對(duì)ＣＯＤ降解起一定的作用［１４］。微生物降解ＣＯＤ的機(jī)理可能分為兩個(gè)階段：第一階段與代謝無關(guān)，為生物降解過程，在此過程中，水樣中的還原性物質(zhì)可能通過配位、螯合、離子交換、物理降解及微沉淀等作用中的一種或幾種復(fù)合至細(xì)胞表面。在此階段中微生物的作用較快；第二階段為生物累積過程，在此階段中還原性物質(zhì)被運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)。生物累積過程和細(xì)胞代謝直接相關(guān)［１４，１５］。

綜上所述，在３７℃、１．０ ｇ降解劑、ｐＨ值為7左右、振蕩時(shí)間9０ ｍｉｎ、搖床轉(zhuǎn)速１１５ ｒ／ｍｉｎ時(shí)，效果較佳。達(dá)到國(guó)家規(guī)定海水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的二類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，符合養(yǎng)殖海水標(biāo)準(zhǔn)（清潔海水ＣＯＤ≤２ ｍｇ／Ｌ，較清潔海水ＣＯＤ≤３ ｍｇ／Ｌ，輕微污染海水ＣＯＤ≤４ ｍｇ／Ｌ，中度污染海水ＣＯＤ≤５ ｍｇ／Ｌ）。

３結(jié)論

通過海藻酸鈉固定化鞘氨醇單胞菌對(duì)海水ＣＯＤ降解的試驗(yàn)，在搖床轉(zhuǎn)速、溫度、ｐＨ值、降解劑質(zhì)量因素中，ｐＨ值對(duì)海水ＣＯＤ降解的影響最大。其中，溫度是一個(gè)較主要的因素。由于降解反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過程，所以降解量和降解率會(huì)隨著溫度的升高而增大；ｐＨ值同樣也是一個(gè)影響因素，試驗(yàn)中降解量和降解率隨著ｐＨ值的升高先升后降，一般ｐＨ值為7左右，降解效果較佳；培養(yǎng)24 h的微生物做成的小球降解效果最好。處理后的海水達(dá)到國(guó)家規(guī)定海水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的二類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，符合養(yǎng)殖海水標(biāo)準(zhǔn)。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文