湖北襄陽地區規模化牛場產氣莢膜梭菌的分離和鑒定

2011-12-31 00:00:00鄭曉麗竇賢明胡道俊肖勇趙翠榮倪學勤

湖北農業科學 2011年23期

摘要：為了檢測湖北襄陽地區規模化牛場產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）的分布現狀，調查健康牛群中該菌的流行情況，從襄陽地區４個規模化牛場采集樣品進行產氣莢膜梭菌的分離和鑒定。經過選擇性培養基分離培養，結合菌落特征、革蘭氏染色鏡檢和生化試驗鑒定，結果從６８個新鮮糞便樣品和２４個環境樣品中共分離得到產氣莢膜梭菌８株，分離率為８．７％。表明襄陽地區健康牛群中的產氣莢膜梭菌與報道的國內其他地區相比檢出率較低。

關鍵詞：牛場；產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；分布現狀；分離；鑒定；襄陽地區

中圖分類號：Ｓ８５２．６１；Ｓ８５８．２３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）23－4893-03

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｆｒｏｍＳｃａｌｅＣａｔｔｌｅＦａｒｍｓｉｎＸｉａｎｇｙａｎｇ，Ｈｕｂｅｉ

ＺＨＥＮＧＸｉａｏ－ｌｉ１，ＤＯＵＸｉａｎ－ｍｉｎｇ１，ＨＵＤａｏ－ｊｕｎ２，ＸＩＡＯＹｏｎｇ１，ＺＨＡＯＣｕｉ－ｒｏｎｇ１，ＮＩＸｕｅ－ｑｉｎ３

（１．ＸｉａｎｇｙａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｉｎＨｕｂｅｉ，Ｘｉａｎｇｙａｎｇ４４１０５７，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；

２．ＡｎｇｕｓＣａｔｔｌｅＦａｒｍｏｆＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｘｉａｎｇｙａｎｇ４４１１０６，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；

３．ＡｎｉｍａｌＭｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ４ｓｃａｌｅｃａｔｔｌｅｆａｒｍｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｔｅｓｔｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＣ. ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｎｓｃａｌｅｃａｔｔｌｅｈｅｒｄｓｉｎＸｉａｎｇｙａｎｇ of Ｈｕｂｅｉａｎｄｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｉｔｕａｔｉｏｎｉｎｈｅａｌｔｈｙｃａｔｔｌｅｈｅｒｄｓ was ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ．Ｔｈｒｏｕｇｈｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｓｏｌａｔｅｄｃｕｌｔｕｒｅ，８ｓｔｒａｉｎｓｏｆＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ６８ｆｒｅｓｈｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓａｎｄ２４ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓｃｏｎｂｉｎｉｎｇｔｈｅｃｏｌｏｎｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎａｆｔｅｒｇｒａｍｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｉｎｔｈｅｈｅａｌｔｙｃａｔｔｌｅｈｅｒｄｓｏｆＸｉａｎｇｙａｎｇ was ８．７％ that ｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｒｅｇｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎａ．

Ｋｅｙｗｏｒｄs： cａｔｔｌｅ farm；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Xiangyang

產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）又稱魏氏梭菌，是一種重要的人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界，也是人和動物腸道中的常在菌之一，能產生多種外毒素，對人和動物致病，是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥及人類食物中毒和創傷性氣性壞疽的主要病原菌之一［１］。產氣莢膜梭菌病主要是由產氣莢膜梭菌引起的條件性高度致死性傳染病。該菌導致的動物猝死癥發病急、病程短、死亡率高，各類家畜均有發病，尤以牛的發病最多。產氣莢膜梭菌能使不同年齡、不同品種的牛（包括黃牛、奶牛、水牛等）發病，且一年四季均有發生，引起的黃牛死亡率高達９５％以上，奶牛為５０％～１００％，牦牛為１４．３%～１００％［２－６］。該病的發生給養牛業的發展造成了嚴重的威脅。

在我國，產氣莢膜梭菌病在２０世紀８０年代就有零星發生，以犢牛發病為主；９０年代以來，該病日趨嚴重，牛的發病數量急速增多，發病地區也不斷擴大，給養牛業造成了巨大的經濟損失［７，８］。９０年代湖北地區發生的一系列耕牛“猝死癥”，經廣泛調查其主要病原也是產氣莢膜梭菌。由于對該病的認識不足，防治工作收效不大，給湖北省農牧業造成了較大的危害［９，１０］。目前湖北省對該菌相關的研究報道仍較少，更缺乏良好的防控措施，應加強相關方面的研究。本研究對襄陽地區規模化牛場的產氣莢膜梭菌存在現狀進行了調查，監測健康牛群中該菌的流行情況，在此基礎上掌握該地區規模化牛場產氣莢膜梭菌病的流行現狀和分布特點，探索其防治方法，為最終控制牛產氣莢膜梭菌病提供科學依據和有效的防治措施，對該病的防治研究具有重要意義。

１材料和方法

１．１樣品采集

采集襄陽地區宜城、棗陽等地的４個規模化牛場健康牛群的６８份新鮮糞便樣品和２４份環境樣品。糞便取樣，用無菌塑料紙采集３０～６０ｍｉｎ內的新鮮糞樣，立即放入冰盒中送回實驗室。牛場環境取樣，用無菌塑料紙盡量采集當天牛舍內的殘余飼料、墊料等，立即放入冰盒中送回實驗室。

１．２培養基

厭氧增菌（ＰＹ）培養基、卡那霉素卵黃瓊脂（ＣＷ）培養基、紫牛乳培養基、皰肉培養基等均按常規方法制備。

１．３菌株的分離與鑒定

１．３．１樣品接種無菌操作下將采集的樣品分別稱取５ｇ，加入１００ｍＬ帶玻璃珠的三角瓶中，與４５ｍＬ０．８％滅菌生理鹽水在搖床上３７ ℃、１６０ｒ／ｍｉｎ充分勻質３０ｍｉｎ，將混懸液移取１ｍＬ置９ｍＬ滅菌厭氧增菌湯中，混合均勻后于４３ ℃厭氧培養１８ｈ，每隔２ｈ搖晃１次。然后取增菌培養物劃線于ＣＷ選擇性鑒別培養基中分離培養２４ｈ，觀察細菌的生長及白濁環產生情況。

１．３．２分離培養在ＣＷ選擇性鑒別培養基中選擇產生白濁環的單菌落進一步劃線純化培養，然后再接種于１％葡萄糖鮮血瓊脂平板，４３ ℃培養１８ｈ，選擇呈雙層溶血環的單個菌落，涂片、革蘭氏染色鏡檢觀察，選取呈現兩端鈍圓的革蘭氏陽性大桿菌菌株。

１．３．３牛乳發酵試驗進一步挑取呈現產氣莢膜梭菌典型菌落形態的單個菌落接種紫牛乳培養基進行初步鑒定［１１］，４３ ℃厭氧培養６～９ｈ后觀察是否出現爆裂發酵現象，產生爆裂發酵現象的菌株作為受試菌株。

１．３．４生化試驗將分離培養的純細菌單菌落分別接種厭氧增菌湯，４３ ℃厭氧培養１２ｈ，待培養基變混濁、產氣明顯時，取培養液分別接種到硝酸鹽、明膠液化、硫化氫及葡萄糖、麥芽糖、乳糖、靛基質、甘露醇等生化培養基，用蠟封口后，３８ ℃培養７２ｈ，觀察結果。

１．３．５增菌培養及保存將受試菌株的菌落在葡萄糖鮮血瓊脂平板上連續純化２～３次后，挑取純菌株接種于皰肉培養基，４３ ℃厭氧培養１２ｈ，待培養基變混濁、產氣明顯，取部分菌懸液加３０％的甘油于－７０ ℃保存備用。

２結果與分析

２．１厭氧培養結果

部分樣品在ＣＷ選擇性鑒別培養基中厭氧增菌培養１８ｈ后見有細菌生長，為圓形、微隆起、中等大小、表面有褶皺、周圍形成白濁環的單菌落。在１％葡萄糖鮮血瓊脂平板上呈現圓形、微隆起、中等大小、表面光滑、邊緣整齊、半透明、周圍有雙層溶血環的單菌落。

２．２鏡檢結果

挑取平板上單菌落作菌體形態和運動性觀察，可見革蘭氏陽性、菌體兩端鈍圓、呈粗桿狀、單個、成雙或者成短鏈狀存在、無鞭毛、不運動、有莢膜的梭菌，很少見到芽孢，疑似為產氣莢膜梭菌。

２．３牛乳發酵試驗結果

將分離菌接種含鐵的溴甲酚紫牛乳培養基后，可見培養基由淡藍變淡黃色，呈現典型的爆裂發酵現象，即牛乳凝固，同時產生的大量氣體使凝塊變成多孔的海綿狀，該現象為產氣莢膜梭菌的特征性鑒定反應，可初步判斷該菌為產氣莢膜梭菌。

２．４生化試驗結果

生化試驗檢測結果見表１。試驗結果表明，分離到的菌株生化特性基本一致，能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，且產氣；硝酸鹽還原陽性，能液化明膠，能產生硫化氫，不分解甘露醇和水楊苷，不產生吲哚、靛基質。根據文獻［１２］關于產氣莢膜梭菌的生化圖譜，可確認這８株菌株均為產氣莢膜梭菌。２．５增菌培養結果

增菌培養后的厭氧增菌湯和皰肉湯變得異常混濁，產氣明顯，菌液表面有氣泡產生。

２．６菌株分離及鑒定結果

菌株的分離鑒定結果見表２。經過ＣＷ選擇性鑒別培養基、紫牛乳培養基及鮮血瓊脂平板的分離和篩選、革蘭氏染色鏡檢及生化試驗鑒定結果，從６８份新鮮糞便樣品和２４份環境樣品中共分離得到８株產氣莢膜梭菌，該菌的分離率為８．７％。

３討論

產氣莢膜梭菌是一種條件性致病菌，其發病原因與菌株特性和環境因素密切相關。一方面該菌株廣泛分布于自然界，形成芽孢以后對自然環境的抵抗能力較強，可長期存在于土壤中，當畜舍環境衛生條件較差，牛采食被產氣莢膜梭菌污染的飼草或飲水后，可引發此病。另一方面，產氣莢膜梭菌存在于牛腸道內，當飼料、氣候等條件發生急劇改變時，牛的抵抗力下降，腸道內的菌群失調，原有的產氣莢膜梭菌得以大量增殖，產生毒素，也易引發此病。大量的研究表明，環境中存在的產氣莢膜梭菌與動物體內的產氣莢膜梭菌密切相關，該菌可以通過污染的土壤、水、灰塵、飼料、墊草、器具等傳播［１３］。此外，產氣莢膜梭菌是腸道內常在菌，檢測糞便中產氣莢膜梭菌的情況能夠反映出腸道中該菌的存在情況。牛產氣莢膜梭菌病的暴發應與牛體內和畜舍內產氣莢膜梭菌的存在密切相關［１４］。因此，本研究對牛舍環境和糞便內產氣莢膜梭菌的調查可以實現對該病的預防和監控。對暴發過該病的地區，能掌握其地方流行型，便于合理采取防治措施。

本試驗采集了襄陽地區４個規模化牛場的９２份樣品進行產氣莢膜梭菌的分離，該菌的分離率為８．７％，與已報道的國內其他地區相比較低，如對山東疫區幾個規模化牛場糞便和環境樣品中的產氣莢膜梭菌進行檢測的分離率為１０．０％～２２．５％［１５，１６］，分析原因可能與地域和氣候存在差異有關。有報道對雞產氣莢膜梭菌的遺傳多樣性進行分析，表明產氣莢膜梭菌的流行特點與地區差異密切相關［１７］。一方面是由于飼養管理條件及各個地區地理、氣候條件等的差異會對該菌產生影響；另一方面由于該病在不同地區的發生情況和流行史不同，不同的流行情況對該菌的存在也產生影響，即暴發過產氣莢膜梭菌病地區的牛場與健康牛群產氣莢膜梭菌的存在情況可能存在較大差異，暴發過產氣莢膜梭菌病的牛場其產氣莢膜梭菌有可能處在一個相對較高的水平，其演變機理還有待進一步研究。

產氣莢膜梭菌是一種重要的引起人和動物發病的病原微生物，它存在較多的血清型，該病暴發時危害嚴重，發病急，病程短，牛群常未見癥狀即突然死亡［７，１８］，治療的效果不佳，因此預防疫情的暴發十分必要。要采取準確有力的防控措施，必須提早做好調查，采用合適的疫苗，針對不同的血清型采用不同的抗原成分。

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