豬卵母細胞極體排出的規律

摘要：試驗把豬卵丘－卵母細胞復合體（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ）于體外分別培養２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，觀察它們在不同時間排出的極體數，以研究體外卵母細胞排出極體的規律。結果表明，Ａ級和Ｂ級的ＣＯＣｓ培養４８ ｈ的極體排出率最高 （８３．２％和65.7％），明顯高于同級水平培養２４、３２和３８ ｈ的；不同級別ＣＯＣｓ體外培養相同時間后，Ａ級與Ｂ級的極體排出率差異不顯著（Ｐ﹥０．０５），但兩者與Ｃ級的差異顯著 （Ｐ﹤０．０５）。由此可見，Ａ級、Ｂ級ＣＯＣｓ 能獲得高的極體排出率，培養４８ ｈ的極體排出達到高峰，排出過程呈現前期上升快、后期下降慢的變化趨勢。

關鍵詞：豬；卵丘－卵母細胞復合體；體外成熟；極體

中圖分類號：Ｓ８２８；Ｓ８１４．８ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5172-03

Ｔｈｅ Ｒｕｌｅ ｏｆ Ｐｏｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｉｇ Ｏｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ

ＬＩＵ Ｘｉ－ｍｅｉ１，ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ２，ＷＥＩ Ｑｉｎｇ－ｘｉｎ１，ＱＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＬＩ Ｌｉ１，ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ１

（１ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ （ＣＯＣｓ） ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｓｕｃｈ ａｓ ２４ ｈ， ３２ ｈ， ３８ ｈ， ４４ ｈ， ４８ ｈ ａｎｄ ５４ ｈ， ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｕｌｅ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒｕｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ４８ｈ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ （８３．２％ ａｎｄ 65.7％）， ａｎｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｖｅｌ ＣＯＣｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ２４ ｈ， ３２ ｈ ａｎｄ ３８ ｈ． Ｔｈｅ ｐｏｌａｒ ｒａｔｅ ｏｆ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌ Ａ ａｎｄ Ｂ ａｔ the ｓａｍｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）， ｂｕｔ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ Ｃ（Ｐ﹤０．０５）． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＯＣｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌ Ａ ａｎｄ Ｂ ｍｉｇｈｔ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈｅｓｔ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｒａｔｅ ａｔ ４８ ｈ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒｕｄｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｑｕｉｃｋｌｙ ｉｎ ｆｏｒｅｐａｒｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎ ａｆｔｅｒｐａｒｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ； ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ； ＩＶＭ； ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ

豬的體細胞克隆技術研究遠遠落后于其他動物，其主要原因是豬卵母細胞的體外成熟質量比較差、顯微操作難度大，加上妊娠維持困難等問題還沒有得到解決，所以直到２０００年才有所突破，獲得了體細胞克隆后代［１－３］。但豬體細胞核移植重構胚的體外發育率仍然相當低，只有大約１％的克隆胚移植后能完成妊娠；其中去核是體細胞克隆的一個重要環節，去核能否成功直接影響到核移植的效率［４］。目前，盲吸法在豬卵母細胞去核中的應用比較多；盡管盲吸輔助熒光染料Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２的染色法能提高去核的效率，但有些學者并不支持這種做法。然而盲吸去核的質量好壞和效率高低與卵母細胞的成熟時期密切相關，成熟時間延長，卵齡增加，會使第一極體與中期染色體的位置發生偏轉；若去核不完全則會導致克隆胚染色體出現不完整性，造成卵裂異常，影響克隆胚的發育。因此，確定豬卵母細胞體外成熟的最佳時期，是體細胞核移植中盲吸去核成敗的關鍵。試驗根據豬卵丘－卵母細胞復合體（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＣＯＣｓ）的卵丘細胞層數，把ＣＯＣｓ分成Ａ、Ｂ、Ｃ和 Ｄ ４個級別，并把前３級的ＣＯＣｓ分別體外培養２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，以比較它們在不同時間里的發育情況，從而確定ＣＯＣｓ體外成熟的最佳時期，為后續研究奠定基礎，也為提高豬體細胞核移植技術提供理論依據。

１ 材料與方法

１．１ 材料

杜氏磷酸緩沖液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＤＰＢＳ）購自Ｇｉｂｃｏ公司，孕馬血清促性腺激素（ＰＭＳＧ）、人絨毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）為寧波激素制品廠產品，其他試劑如未特別注明的，均購自Ｓｉｇｍａ 公司。卵母細胞體外培養液為改良的Ｍ１９９（ｍＴＣＭ１９９），在其中添加了３．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ 葡萄糖、０．９１ ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸鈉、０．５７ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－半胱氨酸、１．００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－谷氨酰胺、１０ ＩＵ／ｍＬ ｈＣＧ、１０ ＩＵ／ｍＬ ＰＭＳＧ、20萬ＩＵ／ｍＬ 青霉素、５０萬ＩＵ／ｍＬ 硫酸鏈霉素、１０％豬卵泡液（ｐＦＦ）；洗卵液用ＤＰＢＳ；融合／激活液由０．２５ ｍｏｌ／Ｌ 甘露醇、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鈣、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸鎂、０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ４－羥乙基哌嗪乙磺酸［Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ′－（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＨＥＰＥＳ］緩沖液以及質量濃度為０．１ ｍｇ／ｍＬ的聚乙烯醇（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ，ＰＶＡ）組成；脫卵液用質量濃度為1．0 ｍｇ／ｍＬ的透明質酸酶DPBS液；胚胎培養液為ＮＣＳＵ－２３（Ｎｏｒｔｈ cａｒｏｌｉｎａ sｔａｔｅ uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ－２３）加質量濃度為４ ｍｇ／ｍＬ的牛血清白蛋白（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｎ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）組成。

１．２ 方法

１．２．１ ＣＯＣｓ的采集和分級培養 豬卵巢采自當地屠宰場，置于盛有２８～３７ ℃ 生理鹽水（含青霉素２０萬ＩＵ／ｍＬ、鏈霉素１５萬ＩＵ／ｍＬ）的保溫瓶內，２ ｈ內送回實驗室，用適量生理鹽水（２８～３７ ℃）沖洗３～５遍，采用１０ ｍＬ注射器（１６號針頭）抽吸卵泡，卵泡液置于３７ ℃水浴保溫的５０ ｍＬ離心管中，靜置１５～２０ ｍｉｎ，棄上清液，實體顯微鏡下觀察，撿取ＣＯＣｓ，轉移到ＤＰＢＳ 液滴中沖洗３遍。根據卵丘細胞的層數將ＣＯＣｓ分為４ 級，其中Ａ級為包裹５層以上的卵丘細胞；Ｂ級為包裹３～５層的卵丘細胞；Ｃ級為包裹１～３層的卵丘細胞；Ｄ級則是裸卵、死卵。各級別的ＣＯＣｓ再用體外培養成熟（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ， ＩＶＭ）培養基洗滌３遍，放入３９ ℃、１００％相對空氣濕度、５％（體積分數，下同）ＣＯ２含量的培養箱中進行培養。另取Ａ、Ｂ、Ｃ ３個級別的ＣＯＣｓ用于體外培養，培養時間分別為24、32、38、44、48、54 h，Ａ、Ｂ、Ｃ ３個級別的ＣＯＣｓ形態見圖１。

１．２．２ 豬卵泡液制備 抽取卵巢上直徑３～８ ｍｍ的卵泡，將抽取液放入離心管中，以１ ６００ ｒ／ｍｉｎ離心１８ ｍｉｎ，上清液用０．２２ μｍ濾膜過濾后，分裝于０．５ ｍＬ離心管中，－２０℃冷凍保存備用。

１．２．３ ＣＯＣｓ體外成熟 將體外培養不同時間的ＣＯＣｓ，在實體顯微鏡下觀察卵丘細胞擴散情況，用含１.0 ｍｇ／ｍＬ透明質酸酶的ＤＰＢＳ液脫除包裹在周圍的卵丘細胞，選擇胞質均勻且排出第一極體的卵母細胞做孤雌激活。

１．２．４ 培養不同時間ＣＯＣｓ的孤雌激活 取上述脫去卵丘細胞的ＣＯＣｓ，用激活液洗滌３遍。再將ＣＯＣｓ轉移到已經鋪滿激活液、電極寬度為１ ｍｍ的融合槽（美國ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１電融合儀配套電激活槽）中，電融合參數設定為１個１０Ｖ、５ ｓ的交流電（ＡＣ）刺激，緊接著是１個１．６ ｋＶ／ｃｍ、６０ μｓ的直流脈沖（ＤＣ）。之后用ＮＣＳＵ－２３加４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ的胚胎培養液洗滌ＣＯＣｓ ５遍，洗滌后將ＣＯＣｓ轉移到ＮＣＳＵ－２３加４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ液滴內，放入３９ ℃、１００％相對空氣濕度、５％ ＣＯ２含量的培養箱中培養４８ ｈ后，觀察細胞發育的卵裂情況。試驗所得數據應用ＳＰＳＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０）軟件進行χ２檢驗。

２ 結果與分析

２．１ ＣＯＣｓ的培養

將ＣＯＣｓ分別培養２４、３２、３８、４４、４８和５４ ｈ，然后加入１．０ ｍｇ／ｍＬ的透明質酸酶，反復吹打去除卵丘細胞，用ＤＰＢＳ液清洗２～３次，于倒置顯微鏡下觀察極體的排出情況，結果見圖２。

２．２ ＣＯＣｓ極體排除規律

試驗在同樣的條件下培養相同的時間，觀察、統計排出極體的ＣＯＣｓ數量。結果見表１。從表１可見，Ａ級和Ｂ級ＣＯＣｓ極體排出率之間在相同時間內差異不顯著（Ｐ﹥０．０５），但兩者與Ｃ級ＣＯＣｓ極體排出率相比差異顯著（Ｐ﹤０．０5）。而各級ＣＯＣｓ極體的排出都是從培養２４ ｈ開始出現的，隨著時間延續而上升，于培養４４～４８ ｈ達到高峰；之后開始下降。這說明ＣＯＣｓ是在逐漸成熟，并于極體排出高峰之后開始老化。同時，從各級ＣＯＣｓ在體外培養的極體排出動態（圖３）可以清晰地看出，不同級別ＣＯＣｓ于體外培養同一時間的極體排出率變化基本呈現出前期上升快、后期下降慢的變化趨勢。

３ 討論

試驗根據ＣＯＣｓ的卵丘細胞層數將ＣＯＣｓ分成Ａ級、Ｂ級和Ｃ級，并分別進行培養，獲得Ａ級、Ｂ級和Ｃ級ＣＯＣｓ極體排出的最佳時期，同時對Ａ級、Ｂ級和Ｃ級ＣＯＣｓ體外培養相同時間排出極體的數量進行了比較。結果表明，ＣＯＣｓ周圍卵丘細胞層數對ＣＯＣｓ的極體排出具有明顯的影響，Ａ級、Ｂ級ＣＯＣｓ有利于體外培養，能獲得較高的極體排出率，這可能與ＣＯＣｓ的卵丘細胞層數有關。據報道，ＣＯＣｓ的卵丘細胞層數和質量是影響ＣＯＣｓ極體排出的重要因素之一［５，６］。ＣＯＣｓ的體外成熟是伴隨卵丘細胞的擴散發生的，擴散的卵丘細胞能夠調節諸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白質等物質在ＣＯＣｓ內的進出，誘導從ＣＯＣｓ排出有害因子，從而有效地抑制ＣＯＣｓ的退化［７］。而ＣＯＣｓ在生長發育中所釋放的生長因子對卵丘細胞的發育也有一定的促進作用。ＣＯＣｓ與卵丘細胞的這種相互作用使得兩者共同發育生長，最終促進了ＣＯＣｓ的成熟而排出極體［８，９］。

試驗發現，Ａ級、Ｂ級ＣＯＣｓ體外培養４８ ｈ的極體排出達到高峰，與培養４４ ｈ的極體排出率差異不明顯，但明顯高于培養３８ ｈ及之前的處理，而培養４８ ｈ后呈下降趨勢，而且卵周間隙明顯增大；Ｃ級ＣＯＣｓ的極體排出率明顯較低，這可能與卵丘細胞少、老化嚴重有關［１０］。極體排出是卵母細胞成熟的重要標志，通過此試驗，發現極體排出過程呈現前期上升快、后期下降慢的變化趨勢，從中也驗證了ＣＯＣｓ的成熟時間是在培養４４～４８ ｈ左右，而且Ａ級、Ｂ級ＣＯＣｓ適合在體外進行培養。

參考文獻：

［１］ ＰＯＬＥＪＡＥＶＡ Ｉ Ａ， ＣＨＥＮ Ｓ Ｈ， ＶＡＵＧＨＴ Ｔ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７：８５－９０．

［２］ ＯＮＩＳＨＩ Ａ， ＩＷＡＭＯＴＯ Ｍ， ＡＫＩＴＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｇ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］． Ｓｃｉｎｅｃｅ，２０００，２８９：１１８８－１１９０．

［３］ ＢＥＴＴＨＡＵＳＥＲ Ｊ， ＦＯＲＳＢＥＲＧ Ｅ， ＡＵＧＥＮＳＴＥＩＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００， １８：１０５５－１０５９．

［４］ ＷＯＬＦ Ｄ Ｐ， ＭＩＴＡＬＩＰＯＶ Ｓ， ＮＯＲＧＲＥＮ Ｒ Ｂ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｊ］． Ａｒｃｈ Ｍｅｄ Ｒｅｓ，２００１，３２：６０９－６１３．

［５］ 陳曉宇，劉 東，李青旺． 豬卵巢卵母細胞的收集和體外成熟培養［Ｊ］． 云南畜牧獸醫， ２００３，１９（４）：３９－４１．

［６］ ＳＨＩＲＡＺＩ Ａ， ＳＡＤＥＧＨＩ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｖｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｓｍａｌｌ Ｒｕｍｉｎａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，６９：１０３－１０７．

［７］ ＧＥ Ｌ， ＳＵＩ Ｈ Ｓ， ＬＡＮ Ｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｄｅｎｕｄｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｍｕｌｕｓ ｏｏｐｈｏｒｕｓ： ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ［Ｊ］． Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，２００８，９０：２３７６－２３８８．

［８］ ＫＲＩＳＨＥＲ Ｒ Ｌ， ＢＲＡＤ Ａ Ｍ， ＨＥＲＲＩＣＫ Ｊ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，２００７，９８：７２－９６．

［９］ ＺＨＡＮＧ Ｘ， ＭＩＡＯ Ｙ Ｌ， ＺＨＡＯ Ｊ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｄｅｎｕｄｅｄ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃａｎ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｈｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ ｉｆ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｃｕｍｕｌｏｕｓ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉence，２０１０，９：２５－２７．

［１０］ 董雅娟，柏學進，李建棟，等． 豬ＩＶＭ卵母細胞孤雌激活及體外培養發育試驗［Ｊ］． 萊陽農學院學報，２００４，２１（１）：１－５．