農桿菌介導的氮高效利用轉基因水稻植株的獲得

摘要：將從深海硅藻中克隆的與氮具有高度親和性的硝酸鹽轉運蛋白基因ＮＡＴ３通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，轉入水稻品種中花１１，在含３０ ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ的選擇培養基上篩選，獲得４５６棵抗性植株，對ＮＡＴ３目標基因檢測，獲得３１３棵陽性植株，初步證明目標基因已整合到中花１１基因組中。

關鍵詞：轉基因水稻；硝酸鹽轉運蛋白；氮高效利用

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｑ７８ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5247-03

Transgenic High N Use Efficiency Rice Obtained by Agrobacterium tumefaciens

ＺＨＡ Ｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＹＩＮ Ｄｅ－ｓｕｏ，ＤＵ Ｘｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩ Ｈｕａ－ｘｉｏｎｇ

（Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｎｉｔｒａｔｅ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ １１’ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ４５６ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ３０ ｍｇ／Ｌ ｂａｓｔａ． ３１３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ １１’．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： transgenic ｒｉｃｅ； ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ； ｈｉｇｈ Ｎ ｕｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ

植物的生長需要合適的氮量，氮是限制植物生長的重要因素［１］。硝酸鹽（ＮＯ３－）是植物主要氮源之一，硝酸鹽供應量的不足經常成為限制作物生長的因素［２－４］。但過量硝酸鹽如果沒有被植物吸收，極易通過淋失、滲透等途徑轉移到水環境中，造成水體硝酸鹽污染的潛在危險，對生態環境和人體健康產生極為不利的影響［５］。氮肥施用量對晚稻產量和氮肥利用效率有影響，采用氮素運籌可影響免耕移植水稻產量及氮素利用率［6，7］。因此，提高氮肥的利用效率，對于促進氮肥的高效利用和減輕環境污染具有重要的意義。水稻是最早通過基因工程手段進行品種改良的作物之一，我國的轉基因生物新品種培育重大專項也已實施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的轉基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的轉基因水稻新種質。

該研究通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將從深海硅藻中克隆的與氮具有高度親和性的硝酸鹽轉運蛋白基因ＮＡＴ３導入中花１１中，旨在培育氮肥高效利用的轉基因水稻，減少氮肥施用量，節約水稻生產成本，從而降低環境污染，促進農業高效節能、可持續發展。

１ 材料與方法

１．１ 材料

用于研究的水稻材料為中花１１，植物表達載體由中國農業科學院生物技術所劉昱輝博士惠贈，根癌農桿菌菌株為ＥＨＡ１０５。

１．２ 方法

1.2.1 水稻胚性愈傷組織的獲得 將成熟種子剝殼后放在５０或１００ ｍＬ三角瓶中進行常規消毒，接種于誘導培養基中，每皿約３５～４０粒，封口膜封好后于２８ ℃暗培養。

１．2.2 農桿菌介導的遺傳轉化 農桿菌在ＬＡ培養基上２８ ℃培養2 d后，用藥勺刮取少量菌斑懸浮于含有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的ＬＢ培養基，調整菌液濃度至ＯＤ６００nm＝０．６左右。將經過預培養的水稻成熟胚誘導的胚性愈傷組織置于農桿菌懸浮液中，略微搖動后靜置５ ｍｉｎ，然后將愈傷組織置于培養皿中無菌濾紙上，在超凈工作臺中吹干。最后將愈傷組織轉入添加有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的共培養基上，１８ ℃暗培養３ ｄ。

１．2.3 抗性愈傷組織的篩選 待愈傷組織共培養２～３ ｄ，取出愈傷組織，用無菌水沖洗３～５次，每次搖動數次，直至水中不見絲狀菌體。然后用含２５０ ｍｇ／Ｌ羧芐青霉素的無菌水再清洗一遍，置于無菌濾紙上吹干后，轉移至選擇培養基（添加２５０ ｍｇ／Ｌ羧芐青霉素以及３０ ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ）篩選抗性愈傷組織。每兩周將愈傷組織轉移至新選擇培養基上，約需３次繼代培養獲得抗性愈傷組織。

１．2.4 抗性植株的獲得 將抗性愈傷組織轉移到分化培養基上進行分化培育，每一瓶中可放置３～４塊不同克隆的愈傷組織。１周后愈傷組織開始轉綠，３周后幼苗長到５ ｃｍ時，可進行生根培養。

１．2.5 轉基因植株的ＰＣＲ檢測 ＣＴＡＢ法提取水稻總ＤＮＡ。ＰＣＲ擴增ＮＡＴ３基因片段的引物序列為ＮＡＴＦ：５′-ＧＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣ-３′，ＮＡＴＲ：５′-ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＣＧＧ-３′。擴增目標片段大小為２９６ｂｐ，ＰＣＲ反應條件為：９４ ℃、５ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，５８ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃、１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。以表達載體質粒、中花１１基因組ＤＮＡ分別作為陽性及陰性對照。

２ 結果與分析

２．１ 抗性植株的獲得

中花１１成熟種子在誘導培養基上培養１周，即可看到盾片處有愈傷組織形成，繼續在原培養基上培養１個月，即可獲得顏色鮮黃、質地緊實的顆粒狀胚性愈傷組織（圖１ａ），誘導率達９７．０％。愈傷組織與農桿菌共培養２～３ ｄ后，經脫菌進行選擇培養。約繼代培養３次后，獲得抗性愈傷組織（圖１ｂ），抗性愈傷組織獲得率為７３．４％。抗性愈傷組織經分化培養３～４周可獲得抗性植株（圖１ｃ），分化率為２８.0％。抗性植株在１／２ＭＳ生根培養基上生根率達到９４．５％，共獲得抗性植株456棵。

２．２ 轉基因植株的ＰＣＲ檢測結果

根據ＮＡＴ３基因的序列設計一對特異性引物，對獲得的所有抗性植株進行ＮＡＴ３陽性檢測。有３１３棵檢測到２９６ ｂｐ目的基因片段，陽性率為６８．６％，部分植株檢測結果見圖２。

３ 討論

１）中國的水稻氮肥施用量占全球水稻施用量的３７％，氮肥利用率遠遠低于全球的平均水平；中國水稻種植施用的氮肥占氮肥總使用量的２４％［9］。過量施用氮肥導致環境污染，降低了農民的收入。研究將從海藻中克隆的硝酸鹽轉運蛋白ＮＡＴ３基因，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化水稻品種中花１１中，對獲得的再生植株ＮＡＴ３基因ＰＣＲ檢測表明目標基因ＮＡＴ３已整合到中花１１基因組中。

２）為了明確ＮＡＴ３基因在轉基因水稻中能否提高氮素利用率，對部分目標基因陽性單株進行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ雜交，以期檢測目標基因單拷貝整合的轉基因植株，目前該工作正在進行。并將進一步利用ＲＴ－ＰＣＲ對單拷貝轉基因株系中ＮＡＴ３基因的表達進行分析，篩選出ＮＡＴ３基因不同表達水平的轉基因株系，并對不同株系的節氮效果進行試驗，從而為ＮＡＴ３轉基因水稻的氮素利用效率做出科學評價，為進一步培育氮高效利用新品種奠定基礎。

參考文獻：

［１］ ＭＡＴＴＳＯＮ Ｗ Ｊ，ＨＡＡＣＫ Ｒ Ａ，ＬＡＷＲＥＮＣＥ Ｒ Ｘ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｒｕｃｅ ｂｕｄｗｏｒｍ ｉｎ ｉｔｓ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｆｏｒｅｓｔ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，１９９１，３９：１８３－２１０．

［２］ ＣＲＡＷＦＯＲＤ Ｎ Ｍ，ＧＬＡＳＳ Ａ Ｄ Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，１９９８，３（１０）：３８５－３８９．

［３］ ＤＡＮＩＥＬ Ｖ Ｆ，ＦＩＬＬＥＵＴ Ｓ，ＣＡＢＥＣＨＥ Ｍ． Ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ａ ｋｅｙ ｓｔｅｐ ｉｎ ｎｉｔｒａｔｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，１９９８，１（３）：２３５－２３９．

［４］ ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ｌ Ｅ，ＭＩＬＬＥＲ Ａ Ｊ． Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｔｅｓ［Ｊ］． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ ＰyｓｉｏＩ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，２００1，５２（６）：６５９－６８８．

［５］ ＶＥＲＭＥＥＲ Ｉ Ｔ Ｍ，ＰＡＣＨＥＮ Ｄ Ｍ Ａ Ａ，ＤＡＬＬＩＮＧＡ Ｊ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｎｉｔｒｏｓｍｎｉｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔａｋｅ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ａｔ ｔｈｅ ＡＤＩ ｌｅｖｅＩ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ａｍｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，１９９８，１０６（８）：４５９－４６３．

［6］ 李向輝，魯艷紅，廖育林，等． 氮肥施用量對晚稻產量和氮肥利用效率的影響［Ｊ］．湖南農業科學，２０１０，４９（８）：５２－５４．

［7］ 姜新有，周江明．氮素運籌對免耕移植水稻產量及氮素利用率的影響［Ｊ］． 江西農業學報，２０１１，２３（９）：１０４－１０８．

［8］ 劉 麗，于志晶，張文娟，等． 轉基因抗蟲水稻研究進展［Ｊ］．安徽農業科學，２０１１，３９（９）：５１０９－５１１０，５１４７．

［9］ 彭少兵，黃見良，鐘旭華，等． 提高中國稻田氮肥利用率的研究策略［Ｊ］．中國農業科學，２００２，３５（９）：１０９５－１１０３．