轉(zhuǎn)基因玉米MOＮ863品系特異定量PCR方法的建立

摘要：根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３外源基因的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)引物和ＴａｑMａｎ探針，建立了轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系特異定量ＰＣＲ檢測(cè)方法，并采用該法檢測(cè)了１％含量的ＭＯＮ８６３玉米粉末（不確定度為１０％）。結(jié)果顯示，采用構(gòu)建的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為－３．６～－３．１，相關(guān)系數(shù)大于０．９９，擴(kuò)增效率為１０２．２％，在９０％～１１０％內(nèi)。樣品的定量檢測(cè)結(jié)果１．113％接近已知含量１％（不確定度為１０％），表明建立的轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系特異定量ＰＣＲ檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度高，可以在日常檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：ＭＯＮ８６３；ｚＳＳⅡｂ；旁側(cè)序列；定量檢測(cè)

中圖分類號(hào)：Ｓ５１３；Ｑ５０３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）24－5250-04

Establishment of Event-specific Quantitative PCR of Genetically Modified Maize

（Zea mays） Event MON863

ＳＯＮＧ Ｊｕｎａ，ＬＥＩ Ｓｈａｏ－ｒｏｎｇａ，ＬＩＵ Ｙｏｎｇｂ，ＹＩＮ Ｑｕａｎａ，ＷＡＮＧ Ｄｏｎｇａ，ＺＨＡＮＧ Ｆｕ－ｌｉａ，ＬＩＵ Ｗｅｎ－ｊｕａｎａ，ＣＨＡＮＧ Ｌｉ－ｊｕａｎａ

（ａ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ； ｂ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｖｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｉｚｅ（Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３） ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３． Ｓａｍｐｌｅ（ＣＲＭ） ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １％ ｏｆ Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３ （ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｗａｓ １０％） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｌｏｐｅ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ －３．６～－３．１． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ０．９９； Aｎｄ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ９０％～１１０％（ａｖｅｒａｇｅｄ ａｔ １０２．２％）． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ １．１13％， ｃｌｏｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｕｅ ｃｏｎｔｅｎｔ（１％）． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ＧＭＯ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３； ｚＳＳⅡｂ； ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＭＯＮ８６３轉(zhuǎn)基因玉米是美國(guó)孟山都公司２００３年投放市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，具有防、抗蟲害能力。ＭＯＮ８６３玉米品系是通過(guò)ＤＮＡ重組技術(shù)，表達(dá)編碼一種從蘇云金芽孢桿菌中來(lái)的抗鞘翅類昆蟲的特異殺蟲劑蛋白質(zhì)Ｃｒｙ３Ｂｂ１的基因，來(lái)控制玉米根蠕蟲的橫行。Ｃｒｙ３Ｂｂ１的基因通過(guò)粒子加速轉(zhuǎn)化引入公開可供使用的純種玉米品系Ａ６３４。已有的研究成果表明，Ｃｒｙ３Ｂｂ１沒(méi)有與已知蛋白毒素和過(guò)敏原有同源序列，該蛋白質(zhì)不存在潛在的毒性和過(guò)敏性［１］。２００１年至２００４年，美國(guó)、日本、加拿大、韓國(guó)等國(guó)先后批準(zhǔn)進(jìn)口用作食用或飼料。２００４年４月，歐盟食品安全局確認(rèn)ＭＯＮ８６３安全可靠。２００５年８月，歐盟批準(zhǔn)將這種轉(zhuǎn)基因玉米用于動(dòng)物飼料，２００６年１月批準(zhǔn)其用于人類食品。

２００１年６月６日，國(guó)務(wù)院發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，２００２年１月５日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》等３個(gè)配套管理辦法，明確規(guī)定對(duì)進(jìn)入我國(guó)流通市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度，而對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性或定量檢測(cè)是貫徹標(biāo)識(shí)制度的重要前提，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)顯得十分重要。目前，在我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，只有轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系及其產(chǎn)品定性ＰＣＲ檢測(cè)方法［2］，尚無(wú)定量檢測(cè)方法。

實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）是一種在ＰＣＲ 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)ＰＣＲ進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析的方法［3，４］。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域［５－７］。本研究采用生物信息學(xué)方法，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的相關(guān)序列設(shè)計(jì)特異引物和Ｔａｑｍａｎ探針，建立了轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系特異定量ＰＣＲ方法，以期為ＭＯＮ８６３玉米定量檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料 以含量為１０％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ rｅｆｅｒｅｎｃｅ mａｔｅｒｉａｌ，ＣＲＭ；不確定度為１０％）的ＤＮＡ梯度稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；含量為１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ，不確定度為１０％）作為檢測(cè)樣品（以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性）；含量為１０％和１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ）購(gòu)自ＩＲMＭ［Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，Ｊｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ（ＪＲＣ），Ｂｅｌｇｉｕｍ］；作為陰性對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因玉米為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的樣品。

１．１．２ 儀器 超微量分光光度計(jì)（Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００，Ｔｈｅｒｍｏ），高速冷凍離心機(jī)（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ），７５００ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）等。

１．１．３ 試劑 植物基因組ＤＮＡ純化試劑盒和Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

１．２ 方法

１．２．１ ＤＮＡ提取 稱取含量為１０％、１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ）以及非轉(zhuǎn)基因玉米粉末，各１００ ｍｇ，按照植物基因組ＤＮＡ純化試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說(shuō)明書分離、純化ＤＮＡ。

１．２．２ 引物與探針 采用ＧＢ１９４９５．４—２００４［８］檢測(cè)玉米的內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ，根據(jù)ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段（來(lái)自上海市轉(zhuǎn)基因生物安全性檢測(cè)評(píng)估共享服務(wù)平臺(tái)方法數(shù)據(jù)庫(kù)），設(shè)計(jì)跨越調(diào)控元件和玉米基因組的特異引物和探針（表１）。

１．２．３ ＰＣＲ反應(yīng)體系 將分離純化得到的含量為１０％的ＭＯＮ８６３玉米ＤＮＡ，按照１∶５稀釋成４個(gè)濃度梯度：１００．０、２０．０、４．０、０．８ ｎｇ／μＬ。將含量為１％的ＭＯＮ８６３玉米ＤＮＡ稀釋成濃度為５０.0 ｎｇ／μＬ。取３ μＬ上述ＤＮＡ稀釋液加入到２５ μＬ反應(yīng)體系：Ｔａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ Mｉｘ（２×）１２．５ μＬ，上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，探針（１０ μｍｏｌ／Ｌ）０．５ μＬ，補(bǔ)ddH2O至２５ μＬ。每個(gè)ＤＮＡ濃度稀釋液做３個(gè)平行反應(yīng)，待檢測(cè)樣品做１５個(gè)平行反應(yīng)，然后在７５００ Real-time PCR system上運(yùn)行反應(yīng)程序：５０ ℃，２ ｍｉｎ；９５ ℃，１０ ｍｉｎ；９５ ℃，１５ ｓ；５９ ℃，６０ ｓ（４５個(gè)循環(huán)）。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

該試驗(yàn)通過(guò)梯度稀釋１０％含量的轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３的ＤＮＡ，擴(kuò)增不同濃度的玉米內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段，測(cè)定其Ｃｔ值。根據(jù)Ｃｔ值與ｚＳＳⅡｂ基因含量和ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的不同含量，繪制Ｃｔ值與ｚＳＳⅡｂ基因含量的內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線以及Ｃｔ值與ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段含量的外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。由內(nèi)標(biāo)基因與外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定出樣品（１％ ＭＯＮ８６３，ＣＲＭ）的內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的絕對(duì)含量，再根據(jù)公式“外源基因的絕對(duì)含量／內(nèi)標(biāo)基因的絕對(duì)含量＝外源基因的相對(duì)含量”［１０］，計(jì)算出樣品中ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的相對(duì)含量。

用ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的引物和探針?lè)謩e對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增圖譜見圖１和圖２；獲得的Ｃｔ值見表２。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著ＤＮＡ濃度的降低，其Ｃｔ值相應(yīng)增大；不同濃度梯度ＤＮＡ稀釋液的３個(gè)平行反應(yīng)的Ｃｔ值接近。

平行反應(yīng)間的Ｃｔ值標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明該方法檢測(cè)平行性較好。利用７５００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）自動(dòng)擬合出Ｃｔ值與玉米內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ含量，Ｃｔ值與ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖３和圖４）。Ｃｔ值與玉米內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ的回歸方程為■＝－３．２６２ｘ＋３１．５０７，相關(guān)系數(shù)為ｒ＝０．９９７，擴(kuò)增效率較高，為１０２．６％。Ｃｔ值與ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段含量的回歸方程為■＝－３．２７１ｘ＋３２．１３３，相關(guān)系數(shù)為ｒ＝０．９９８，擴(kuò)增效率為１０２．２％。該試驗(yàn)中的內(nèi)標(biāo)基因與外源基因擴(kuò)增效率較高，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物和探針較好，能夠滿足檢測(cè)需要。

２．２ 待檢樣品（１％轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３，ＣＲＭ）的定量結(jié)果

該試驗(yàn)中待檢樣品共做１５個(gè)平行反應(yīng)，結(jié)果見表３。將獲得的待檢樣品Ｃｔ值代入內(nèi)標(biāo)基因和旁側(cè)片段標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，得到待檢樣品的內(nèi)標(biāo)基因ｚＳＳⅡｂ和旁側(cè)特異片段的絕對(duì)含量（表３）。再根據(jù)公式“外源基因的絕對(duì)含量／內(nèi)標(biāo)基因的絕對(duì)含量＝外源基因的相對(duì)含量”［１０］，計(jì)算出ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的１５次測(cè)量結(jié)果為１．０32％～１．２44％，平均相對(duì)含量為１．１13％，接近已知含量１％（不確定度為１０％），測(cè)量值與已知含量的相對(duì)偏差為１1．3％，小于基因檢驗(yàn)普遍接受的相對(duì)偏差（２５％）。

３ 討論

基因的實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢測(cè)是對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的重要技術(shù)手段。本研究以含量為１０％的轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３（ＣＲＭ）作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的引物和探針，建立了轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系特異的實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢測(cè)方法。

實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ fluorescent quantitative ＰＣＲ）技術(shù)，是目前得到廣泛認(rèn)可的基因定量檢測(cè)技術(shù)，在實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ中，使用頻率最高的是ＴａｑMａｎ探針?lè)āＯ啾龋樱伲拢?Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料法，探針?lè)ň哂袡z測(cè)結(jié)果可靠、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)［１１－１３］，而ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料法往往在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要克服引物二聚體的生成，否者定量結(jié)果不準(zhǔn)確。在探針?lè)ǖ膶?shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ中，探針的設(shè)計(jì)是決定ＰＣＲ擴(kuò)增效率高低的主要因素。探針含有的堿基數(shù)越少，擴(kuò)增效率就越高，但是較短的探針，其Ｔｍ值也較小。現(xiàn)在很多研究采用ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）探針?lè)ǎ摲軌蚪鉀Q較短探針的問(wèn)題，同時(shí)通過(guò)探針結(jié)合的ＭＧＢ多肽提高Ｔｍ值。

若ＰＣＲ擴(kuò)增效率達(dá)到１００％的理想狀態(tài)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)該在－３．３２，然而在實(shí)際操作中，由于抑制物、探針的設(shè)計(jì)等原因，ＰＣＲ的擴(kuò)增效率往往達(dá)不到１００％的擴(kuò)增。在實(shí)際操作中，ＰＣＲ的擴(kuò)增效率在９０％~１１０％內(nèi)，能夠獲得可靠的結(jié)果，而對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的平均值為－３．６～－３．１。Ｒ／ｒ是反映標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性的重要參數(shù)，在基因的定量檢測(cè)中，一般要求相關(guān)系數(shù)Ｒ／ｒ大于或等于０．９９。該試驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３旁側(cè)特異片段的定量ＰＣＲ檢測(cè)方法，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為■＝

－３．271ｘ＋３2．133，相關(guān)系數(shù)為ｒ＝０．９９８，由斜率計(jì)算出的擴(kuò)增效率為１０2．2％，在９０％～１１０％內(nèi)，斜率為

－３．６～－３．１，相關(guān)系數(shù)大于０．９９，待檢樣品的定量檢測(cè)結(jié)果１．113％接近真實(shí)值１％（不確定度為１０％），結(jié)果證明該試驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)基因玉米ＭＯＮ８６３品系特異的定量ＰＣＲ檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度較高，值得在玉米轉(zhuǎn)基因成分的日常檢驗(yàn)中推廣和應(yīng)用。

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