1 200 ITU/mg Bti濃懸浮劑的研制

摘要：通過對蘇云金芽孢桿菌以色列亞種Ｂｔｉ Ｌ－１０菌株進行培養基的改良優化得到一種理化性質好、利于后處理的配方。２００ Ｌ罐發酵效價達３９５ ＩＴＵ／μＬ；通過后處理工藝的優化，得到一種制備１ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ Ｂｔｉ濃懸浮劑路線，即發酵液２次離心并高倍濃縮得到菌漿，添加各種助劑經砂磨機研磨，得到Ｂｔｉ濃懸浮劑產品效價達到１ ２４５ ＩＴＵ／ｍｇ。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種；濃懸浮劑；制備工藝

中圖分類號：Ｓ４８２．３＋９；ＴＱ４５３．５ 文獻標識碼： Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）24－5113-03

Development of 1 200 ITU/mg Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Suspension Concentrate

ＬＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｑｉｎｇ，ＬＩＵ Ｆａｎｇ，ＺＨＯＵ Ｒｏｎｇ－ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ－ｘｉａ，ＹＡＮＧ Ｚｉ－ｗｅｎ

（Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ／ Ｔｈｅ Ｂｒａｎｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The culture medium for highly toxic Bacillus thuringiensis subsp. israelensis L-10 strain was obtained by orthogonal tests of nitrogen source. The formula with good physicochemical properties was conducive to the post-treatment. In the pilot fermentation in 200 L fermentors， the potency of the fermentation broth was 395 ITU/μL. After the optimization of post-treatment， the optimal route of 1 200 ITU/mg Bti suspension concentrate was developed. It was prepared by using fermentation broth to the secondary centrifugation and high-powered concentration， then adding additive and grinding with sand mill. Its titer reached 1 245 ITU/mg against mosquito larva.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ； suspension concentrate； optimal route

蚊類作為主要衛生害蟲之一，除叮刺、騷擾人類及動物外，還傳播瘧疾、絲蟲病、乙腦、登革熱等多種傳染性疾病。防治媒介蚊是控制這類疾病流行的重要措施，而對于尚無有效疫苗的疾病（如登革熱）和對治療藥物產生抗藥性的疾病（如瘧疾），媒介控制在預防其發生和流行方面的重要性就顯得更加突出［１］。化學防治在過去幾十年的蚊類防治中發揮了較大的作用，但化學殺蟲劑的長期大量應用卻導致蚊類抗藥性產生和環境污染等問題。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Ｂｔｉ）是一種對蚊幼蟲有特效作用的病原細菌，Ｂｔｉ在孢子形成時可產生４種主要的伴孢晶體殺蟲蛋白毒素——Ｃｙｔ１Ａ，Ｃｒｙ４Ａ， Ｃｒｙ４Ｂ和Ｃｒｙ１１Ａ［２］，這些蛋白毒素對蚊有高度的專一性，對包括人類在內的脊椎動物和植物無害，可以完全自然降解，不污染環境，防治對象不易產生抗性，可自身再循環，具有較長的持效期，因此有較廣闊的應用和市場前景。

懸浮劑是一種環境友好型的劑型，無粉塵危害，生產安全，以水為分散相，沒有由有機溶劑而造成的易燃及藥害問題，在水中分散性好，粒徑細，可對水噴霧［３］。國外主流Ｂｔｉ產品有Ａｂｂｏｔｔ公司開發的２００ ＩＴＵ／ｍｇ飄浮劑、１ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ水分散顆粒劑、１ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ懸浮劑等，而我國登記的Ｂｔｉ產品只有傳統劑型如２００ ＩＴＵ／μＬ懸浮劑、１ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ可濕性粉劑，存在運輸成本高、有粉塵污染、藥效不好等問題，已不能滿足需求，迫切需要開發新的劑型。本研究著重于１ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ濃懸浮劑的開發。

１ 材料與方法

１．１ 材料

Ｂｔｉ Ｌ－１０菌株由湖北省生物農藥工程研究中心工程技術室分離并保存，斜面培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂，液體發酵培養基碳源為玉米淀粉、玉米粉等，氮源為豆粕、花生粕、蛋白胨、魚粉、大豆蛋白胨、大豆分離蛋白、大豆濃縮蛋白、酵母抽提物等。供試蟲為白紋伊蚊３齡幼蟲。

１．２ 方法

１．２．１ 液體發酵培養基優化 在現有生產配方即對照配方基礎上進行改良，固定碳源為玉米淀粉３％，磷酸二氫鉀０．１％，硫酸鎂０．０５％，碳酸鈣０．２％，玉米漿 ２％，以魚粉、大豆蛋白胨、大豆分離蛋白、大豆濃縮蛋白、酵母抽提物等蛋白質含量高、雜質少、溶解性好的氮源取代生產配方中的豆粕、花生粕、棉子餅粉、酵母粉等市售農副產品，各種配方見表１。按各濃度要求配制好，分裝于５００ ｍＬ三角瓶，每瓶裝量２０ ｍＬ，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，挑取一環菌苔接種于搖瓶中，置于旋轉式搖床振蕩培養，溫度（３０ ±１）℃，轉速２２０ ｒ／ｍｉｎ，培養至芽孢和晶體３０％分離時下搖床，所得發酵液進行生物測定，重復３次，取其平均值。

１．２．２ ２００ Ｌ發酵罐發酵 按優化篩選的最佳培養基各組分配制好培養基，投料體積１２０ Ｌ，消泡劑０．２％，消前ｐＨ ７．５，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，待溫度降至３２ ℃時接入經８０ ℃水浴２０ ｍｉｎ處理的Ｂｔｉ Ｌ－１０孢子懸浮液，通氣量１∶０．６～１．２，培養溫度（３０±１）℃，罐壓０．０５ ＭPａ，發酵過程中取樣鏡檢，芽孢和晶體３０％分離時結束發酵。

１．２．３ Ｂｔｉ Ｌ－１０發酵上清液含固量的測定和可溶性增效因子的檢定 將２００ ｍＬ Ｂｔｉ Ｌ－１０發酵液用臺式高速離心機５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取８０ ｍＬ上清液放入不銹鋼杯中進行冷凍干燥，得到上清液干燥粉，稱重，計算含固量；棄去全部上清液，加入同體積無菌水，將其和發酵液同時進行生物測定，重復３次。

１．２．４ 制備路線的選擇 試驗選用3種制備路線，分別為：

Ａ采取原粉加水的路線。取含量為６ ０００～７ ０００ ＩＴＵ／ｍｇ的Ｂｔｉ Ｌ－１０原粉３００ ｇ，加入１ ０００ ｍＬ水，按照文獻［４］加入防腐劑、懸浮劑、分散劑，充分混合，調ｐＨ至５．０，砂磨機研磨，得到懸浮劑Ａ。

Ｂ采取發酵液濃縮的路線。將４ ０００ ｍＬ發酵液用２００目分樣篩過濾，棄去濾渣，所得濾液調ｐＨ至５．０， 臺式高速離心機５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄去３ ０００ ｍＬ上清液，得到１ ０００ ｍＬ菌漿，按照文獻［４］加入防腐劑、懸浮劑、分散劑，砂磨機研磨，得到懸浮劑Ｂ。

Ｃ采取發酵液濃縮２次離心的路線。將４ ０００ ｍＬ發酵液用２００目分樣篩過濾，棄去濾渣，所得濾液調ｐＨ至５．０， 臺式高速離心機５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄去全部上清液，加水定容至４ ０００ ｍＬ，臺式高速離心機５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄去３ ０００ ｍＬ上清液，得到１ ０００ ｍＬ菌漿，按照文獻［４］加入防腐劑、懸浮劑、分散劑，砂磨機研磨，得到懸浮劑Ｃ。

按照文獻［５］進行懸浮率、分散性測定。分別稱取１００ g ３種懸浮劑，冷凍干燥，得到干燥粉，計算含固量。另將３種懸浮劑分別放置于５４ ℃恒溫培養箱中進行熱貯試驗，放置７ ｄ取出進行生物測定和表觀性狀觀察。

１．２．５ 生物測定 將Ａ、Ｂ、Ｃ ３種懸浮劑分別進行生物測定，供試蟲為白紋伊蚊３齡幼蟲，測定方法參照文獻［６］。

２ 結果與分析

２．１ 液體發酵培養基優化

Ｂｔｉ Ｌ－１０菌株在不同培養基中搖瓶發酵結果如表２。從表２可以看出，配方１、２、３效果均優于對照配方，并且雜質較少，利于后處理，但配方１原材料價格較高，配方２同步率稍差，擴大時會有影響，考慮到大生產中成本因素，選取配方３作為后續研究的配方。

２．２ ２００ Ｌ發酵罐發酵

發酵周期２８ ｈ，發酵２４ ｈ時取樣鏡檢，孢囊形成率為９８％，菌體大小整齊、兩端平直，芽孢端∶晶體端約１∶１。放罐時取樣鏡檢，晶體５０％左右脫落，晶體圓形、大、整齊。

２．３ 上清液生物測定

上清液含固量為３．２ ｇ／１００ ｍＬ，發酵液中可溶性增效因子的檢定結果見表３。從表３可以看出上清液存在與否對效價沒有任何影響，可以認為Ｂｔｉ Ｌ－１０發酵上清液中沒有增效物質，在原藥和濃懸劑的制備中可以考慮棄去上清液，減少可溶性雜質，更有利于得到高含量原藥；同時在濃懸劑的制備中棄去上清液可以降低由于可溶性殘糖等雜質帶來的高黏度。

２．４ 制備路線對懸浮劑表觀和效價的影響

幾種制備路線分別得到的懸浮劑的表觀性狀和效價見表４，效價穩定性情況見表５。因路線Ａ采用原粉加水的工藝，而原粉是由菌漿噴霧干燥得來的，噴霧干燥能耗高、生產成本高、存在粉塵污染等問題，因此采用此工藝很不經濟；路線Ｂ因上清液里殘糖等可溶性雜質含量高達３．２ ｇ／１００ ｍＬ，帶來黏度增加、傾倒困難、防腐難度增加等問題；路線Ｃ盡管增加了一次離心操作，但因離心能耗較低，相較于路線Ａ成本大大減少，并且全程沒有任何粉塵污染。因此路線Ｃ是制備Ｂｔｉ １ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ濃懸浮劑經濟可行的路線，并且熱貯穩定性較好，通過添加各種助劑經砂磨機研磨，得到的Ｂｔｉ濃懸浮劑產品效價達到１ ２４５ ＩＴＵ／ｍｇ。

３ 討論

蚊蠅等衛生害蟲的防治是一個長期的課題，而生物防治方法具有殺傷力強、不污染環境、不傷害天敵、對人類安全、控制作用比較持久等化學防治無法比擬的優點，因此防治蚊幼蟲的藥劑Ｂｔｉ有巨大的市場潛力。美國ＶＢＣ公司Ｂｔｉ １ ２００ ＩＴＵ／ｍｇ濃懸浮劑年銷量可達１ ５００ ｔ左右。

誘變育種、原生質體融合育種、分子育種等育種技術的發展與應用，培養基的優化、發酵工藝的優化，使得發酵水平大幅提高；超濾、納濾、真空薄膜濃縮等技術的發展與應用，帶來后處理技術的革新，可更好地解決濃懸浮劑制備過程中的黏度大、含量低等問題，本課題還將繼續跟蹤深入研究，以期得到更高含量的濃懸浮劑。

參考文獻：

［１］ 宋愛軍，陳 偉，李京玉．登革熱的防控［Ｊ］．畜牧與飼料科學，２０１０，３１（１１－１２）：１５７．

［２］ 鄭大勝，ＮEIL Ｃ，蔡亞君，等．蘇云金桿菌以色列亞種殺蚊蛋白Ｃｙｔ１Ａａ在離中不粘柄菌中的表達［Ｊ］．微生物學報，２００７，４７（２）：２１７－２２０．

［３］ 劉 健，徐 遙，王鎖牢，等． 國內外農藥劑型的發展及現狀簡介［Ｊ］．新疆農業科學，１９９８（４）：１７９－１８１．

［４］ 廖先清，劉 芳，周榮華，等．１７ ６００ ＩＵ／ｍｇ蘇云金芽孢桿菌濃懸浮劑的研制［Ｊ］．湖北農業科學，２０１０，４９（１２）：３０４８－３０５１．

［５］ 劉步林，郭武棣．農藥劑型加工技術［Ｍ］．北京：化學工業出版社，２００１．

［６］ 陳在佴，吳繼星，張志剛．蘇云金桿菌９９－１１菌株培養條件的研究［Ｊ］．湖北農業科學，２００４（２）：５０－５２．