豬呼吸道\\消化道內細菌質粒的提取

摘要：使用多種選擇培養基，通過菌落形態、革蘭氏染色、鏡檢和生化反應，對豬呼吸道、消化道中常規菌群進行初步分類，并使用堿變性法提取質粒。結果從健康豬呼吸道和消化道中分離培養出６６株菌株（兼性厭氧菌），獲得了長沙地區豬呼吸道、消化道中菌群的基本數據，為相關基礎研究和模型應用提供了重要的參考數據；獲得了豐富的質粒ＤＮＡ庫，為進一步針對質粒所具有的耐藥基因相關研究打下基礎。

關鍵詞：豬；呼吸道；消化道；常規菌群；分離鑒定；質粒提取

中圖分類號：Ｓ８５４．４＋３文獻標識碼：B文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）09-0010-03

豬的呼吸道、消化道內寄居了大量細菌，這些細菌的種類很多，有的是有益于豬體，有的則有害。正常情況下，呼吸道、消化道內有益的細菌要比有害的多，因此才能保持適度的平衡［１］。在當前的養殖模式下，整個飼養過程中不斷投入各種藥物，這些藥物對正常菌群的影響是顯而易見的，長期使用后導致正常菌群質粒上形成耐藥基因，易破壞豬體的內環境平衡。而通過實驗室檢測查出質粒上存在的耐藥基因后，可以采取有效措施去掉質粒上的耐藥基因，維持機體內環境的平衡。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１檢測對象采樣地點為長沙市兩個屠宰場及兩個動物醫院。采用隨機方式抽取健康成年豬４１頭，待檢豬觀察無腹瀉、便秘、厭食等異常現象，近期（包括觀察期）未使用抗生素，常規飼喂。檢測取樣前４ｈ禁食。

１．１．２主要儀器與試劑恒溫搖床，電熱恒溫培養箱，臺式高速離心機，無菌工作臺，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機，微量移液槍等；各種培養基（各培養基按常規方法配制）。以上儀器及試劑均由湖南農業大學傳染病實驗室提供。

１．２方法

１．２．１采樣培養用無菌的藥棉擦拭呼吸道、消化道取菌。用無菌生理鹽水浸泡無菌棉拭子后，進入豬直腸２～３ｃｍ或鼻腔、喉頭，取菌后立即分區劃線接種于平板，３７℃條件下培養１８～２４ｈ。

１．２．２細菌培養物的分離培養用水溶液稀釋，涂布法培養，顯微鏡觀察。挑取不同菌落革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，然后再做基本的生化試驗。同時，從瓊脂平板上挑取單個菌落，接種到標準ＬＢ培養基或加血清的ＬＢ培養基中，生長到對數末期，然后從中提取質粒。

１．２．３生化試驗進行乳糖、麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖發酵，硫化氫試驗、尿素試驗、枸櫞酸鈉試驗、蛋白胨水試驗、硝酸鹽還原、液化明膠、ＶＰ試驗。

通過菌落形態觀察、革蘭氏染色鏡檢及生化試驗進行初步鑒定及分類。

１．２．４細菌質粒提取挑單個菌落，接種于０．７５ｍＬ ＬＢ培養基中，３７℃培養過夜。１０ ０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，棄上清；加入２００μＬ ＴＥ（含０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ）重懸，再加２００μＬ ＴＥ保護酚振蕩裂解；１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ；取上清，加２倍體積無水乙醇；１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ；棄上清，沉淀用７５％酒精洗滌，晾干；２０～５０μＬ ＴＥ懸浮沉淀，用５μＬ電泳鑒定［２］。

２結果

２．１細菌染色、培養及生化試驗結果

結合細菌染色、培養特點及生化試驗結果，根據《伯杰細菌手冊》分析結果如下：試驗共分離了６６株菌株，編號為ｈｈ１－ｈｈ６６，其中ｈｈ２６、ｈｈ３０、ｈｈ３１、ｈｈ３２、ｈｈ３５、ｈｈ３８、ｈｈ３９為雙歧桿菌屬，ｈｈ８、ｈｈ１５、ｈｈ１７、ｈｈ２０、ｈｈ２９、ｈｈ４３為乳酸桿菌屬，ｈｈ１、ｈｈ２、ｈｈ６為志賀氏菌屬，ｈｈ３、ｈｈ２３、ｈｈ３７、ｈｈ６１、ｈｈ６３為腸球菌屬，ｈｈ４、ｈｈ５、ｈｈ７、ｈｈ１１、ｈｈ２７、ｈｈ２８、ｈｈ３３、ｈｈ４４、ｈｈ４８、ｈｈ５２、ｈｈ５３為埃希氏菌屬，ｈｈ１２、ｈｈ１３為克雷伯氏菌屬，ｈｈ１０、ｈｈ１８為腸細胞菌屬，ｈｈ５５、ｈｈ５９、ｈｈ６０為白假絲酵母，ｈｈ６４為奈氏菌屬，ｈｈ１９、ｈｈ５４、ｈｈ６６為變形菌屬，ｈｈ２２、ｈｈ５０、ｈｈ５１為丁酸梭菌屬，ｈｈ９、ｈｈ１４、ｈｈ１６、ｈｈ１９、ｈｈ２１、ｈｈ２４、ｈｈ２５、ｈｈ４０、ｈｈ４１、ｈｈ４２、ｈｈ４７為丙酸梭菌屬，ｈｈ４５為鏈球菌屬。另有８株菌株無法判斷，可能是因為細菌的易變異性與質粒的數量可變性，以及操作者在操作過程中人為因素的影響，導致結果的不確定性。

２．２質粒電泳結果

根據電泳結果（圖１－３）得出：有２３株菌株有５條帶（亮），有１２株菌株有５條帶（不亮），有１４株菌株無條帶，有８株菌株有２條帶，有１１株菌株有４條帶。通過細菌質粒提取，進一步分類鑒定此次檢測的豬的消化道、呼吸道有６６株菌株，分別是雙歧桿菌、乳酸桿菌、志賀氏菌、腸球菌、埃希氏菌、克雷伯氏菌、腸細胞菌、白假絲酵母菌、奈氏菌、變形菌、丁酸梭菌、丙酸梭菌、鏈球菌等１０多種菌類。

２．３細菌中質粒的存在

細菌作為一種古老的生物，在地球上存在的年代遠遠長于人類，由于抗生素及其他藥物的應用，細菌為了適應環境免遭傷害形成了多種防衛機制，由此產生的耐藥菌得以存活和繁殖［３］。從試驗中得出細菌所含質粒豐富，在６６株菌株中有質粒的有５２株，占７８．８％，只有２１．２％的細菌無質粒（亦可能質粒丟失）。而質粒上有耐藥基因，它的存在與細菌的耐藥性有密切的聯系，目前細菌耐藥和多重耐藥成為全球關注的問題，提取其耐藥基因，掌握細菌對藥物的耐藥機制才能在臨床工作中制定出正確的給藥方案［４］。本次試驗通過細菌質粒提取，并對其進行分類鑒定，為后續對質粒上相關基因的提取及其作用機制的研究奠定基礎，并為指導臨床實踐提供了依據。

３討論與小結

３．１正常菌群的生物學作用

３．１．１營養作用消化道正常菌群不僅從宿主消化道獲取營養，同時通過幫助消化、合成維生素等對宿主起營養作用。如腸球菌可將蛋白質分解為氨基酸；雙歧桿菌能產生各種酶，將不溶性蛋白、脂肪和糖等變為可溶性。

３．１．２免疫作用正常微生物群中各種類型的細菌均為特異性抗原，能刺激機體產生相應的天然抗體。

３．１．３拮抗作用正常菌群對包括致病菌在內的外在菌入侵動物機體有一定程度的拮抗作用。

３．１．４屏障防御正常菌群是阻止致病菌入侵的生物屏障基礎，并與免疫系統一起執行腸道的防御功能［５］。

３．２微生物群質粒的耐藥基因

人和動物體內存在大量的正常微生物，構成相應的微生態區系，是其生命不可或缺的一部分。這些微生物尤其是動物體正常菌群，不僅對宿主具有防御、營養、免疫等重要生理作用，還參與機會感染等病理過程，是人和動物諸多生理病理現象的重要參與因素［６］。

在生產實踐中，由于抗生素及其他藥物的濫用（如低劑量抗菌促生長劑的長期使用、盲目用藥和超劑量使用等）［７］，進而形成更大選擇壓力，這使得抗菌藥的使用效果變得越來越差，導致正常菌群耐藥性的廣泛產生，使豬體內環境的相對平衡被打破。而細菌抗藥性的流行與耐藥質粒的轉移有很大關系，由耐藥性質粒介導的耐藥菌在世界范圍內急劇增加，而且還朝著介導多重耐藥的方向發展［８］。雖然通過改善養殖條件及使用針對性的疫苗可以減少細菌性疾病的發生，但最主要的防治措施仍然是使用抗菌劑藥物。

目前，在常規藥敏試驗的基礎上，各國研究者利用分子生物學技術對細菌耐藥性的分子流行病學做了大量的研究，進行耐藥基因的檢測及定位、轉移和傳播規律、片段多態性、序列同源性等分析，以期從分子水平上掌握耐藥基因的遺傳機制，為監測和控制細菌的耐藥性奠定理論基礎［９］。了解健康豬呼吸道、消化道正常菌群的質粒分布情況，可為進一步提取正常菌群中質粒的耐藥基因和毒力基因打下基礎，為制定用藥規范、消除細菌耐藥性以及降低其耐藥性的擴散等提供科學依據，對保證我國畜禽養殖業的健康發展和人類健康有重要意義。

參考文獻：

［１］汪植三，廖新俤，詹益全，等．論豬消化道內細菌與健康［Ｊ］．家畜生態，１９９９，２０（２）：３６－４０.

［２］中國畜牧獸醫學會動物微生態學分會．動物微生態研究進展［Ｍ］．北京：北京農業大學出版社，２０００．２４－４３．

［３］張曉梅，王家平，糜祖皇．８０株大腸埃希菌耐藥性及氨基糖苷類修飾酶基因分析［Ｊ］．江蘇大學學報（醫學版），２００６，１６（３）：２４６－２４７．

［４］張德福，劉東．國內外小型豬實驗動物化研究［Ｊ］．微生物學通報，２００４，３９（１０）：１４－１６．

［５］田維毅，王文佳，李海峰，等．貴州小型豬胃腸道正常菌群的初步檢測［Ｊ］．四川動物，２００８，２７（１）：１４５－１４６，１５２．

［７］宋瑋，唐英春，陸堅，等．產質粒介導ＡｍｐＣ酶細菌的耐藥性及分子流行病學研究［Ｊ］．中國抗感染化療雜志，２００４，４（２）：７０－７４．

［８］康白．微生態學原理［Ｍ］．大連：大連出版社，２００２．４２－９９．

［９］王琴，楊萍，胡靜儀，等．６０株肺炎克雷伯菌多重耐藥性及主要耐藥基因的研究［Ｊ］．天津醫藥，２００５，３３（６）：３３８－３４１．