荔枝核降血糖有效部位的研究（一）

姜振國(guó)，任 ，林 ，徐多多，潘 志，高其品

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性病之一，其發(fā)病率僅次于心腦血管疾病、癌癥而居第三位［1］。中藥荔枝核為無(wú)患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子。研究［2］表明，荔枝核具有多種藥理作用，臨床治療肝臟疾患、糖尿病、腫瘤等方面具有較好療效。在前人工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究荔枝核降血糖作用，并對(duì)其化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入分析。為進(jìn)一步研究構(gòu)效關(guān)系和新藥開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)于長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，合格證：SCXK（吉）2003-0004。

1.2 藥材及試劑 荔枝核（市場(chǎng)購(gòu)）；0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司）；鹽酸二甲雙胍片（河南興源制藥有限公司）；STZ（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3·2·1·20，Type）（Sigma公司）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，EC223-189-3）（Sigma公司）；拜糖平（拜耳公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 安妥超越Optium Xceed血糖儀（美國(guó)雅培公司）；3型酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電）；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 荔枝核各部位的提取和分離 取荔枝核藥材50kg，粉碎，加8倍量的95％乙醇加熱回流提取4次，每次6h，濾過(guò)，合并提取液，濾液濃縮、干燥得95％乙醇提取浸膏（LCF）。將醇提浸膏用10倍量水溶解，加入95％的乙醇使其乙醇含量為80％，靜置過(guò)夜，離心，上清液回收乙醇至無(wú)醇味，經(jīng)氯仿脫脂后，用水飽和正丁醇萃取，合并萃取液，回收正丁醇至無(wú)醇味，濃縮后得水飽和正丁醇萃取部位（BF）。將BF加4倍量蒸餾水溶解5次，合并水溶液，濃縮后得水溶部位（BFWD），沉淀干燥后得水不溶部位（BFWI）。

2.2 荔枝核各部位對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

2.2.1 樣品液的制備 取干燥至恒重的各提取物適量，精密稱(chēng)定，加0.067mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）制成每毫升含1mg的溶液，按所需樣品濃度倍比稀釋。

2.2.2 α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法 根據(jù)Pierre等［3］方法反應(yīng)體系以PNPG為底物，在96孔板中加入樣品溶液40μL、0.007 1mg/mL a-D-葡萄糖苷酶溶液40μL，37℃保溫5min后，加入0.150 8mg/mL PNPG溶液20μL，反應(yīng)30min，用0.1mol/L Na2CO3溶液100μL終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)405nm處測(cè)定吸光度。酶活性抑制率=A空白-（A樣品-A背景）A空白×100％。A空白：不加樣品反應(yīng)后的吸收值；A樣品：加入樣品反應(yīng)后的吸收值；A背景：只加樣品的吸收值。

2.3 荔枝核95％乙醇提取物（LCF）對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖作用

2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 40只SD大鼠，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。喂高糖高脂飼料4周后，禁食，測(cè)空腹血糖，一次性腹腔注射1％鏈尿菌素（STZ），30mg/kg體質(zhì)量（現(xiàn)配），分別測(cè)給藥后24、72h斷尾取血血糖，取血糖值＞7.8mmol/L的大鼠重新分組［4-5］選取造模成功大鼠，隨機(jī)分組，空白組正常飼料喂養(yǎng)，模型組及給藥組高脂高糖飼料喂養(yǎng)，采用固定時(shí)間灌胃給藥方式進(jìn)行，二甲雙胍（0.1g/kg體質(zhì)量），荔枝核醇低劑量組（LCFL）（160mg/kg體質(zhì)量），荔枝核醇高劑量組（LCFH，300mg/kg體質(zhì)量），模型組、生理鹽水組分別給等量蒸餾水。

2.3.2 檢測(cè)指標(biāo) 觀察高脂高糖糖尿病模型大鼠體征變化，檢測(cè)給藥2周后血糖變化。

2.4 BF、BFWD和BFWI總糖、總皂苷、總酚的含量測(cè)定

2.4.1 BF、BFWD和BFWI的總糖含量測(cè)定

2.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 取干燥至恒重的葡萄糖適量，精密稱(chēng)定，加水制成每毫升含0.1mg的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0、20、40、60、80、100μL置具塞試管中，分別加水使體積均為1mL后，再加入5％苯酚試液1.0mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL搖勻，放至室溫；以0管作為空白對(duì)照，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸收度。

2.4.1.2 樣品液的制備 分別取干燥至恒重的BF、BFWD和BFWI 25mg置500mL容量瓶中，精密稱(chēng)定，加水溶解至刻度，搖勻，按照上述方法測(cè)定吸收度。

2.4.2 BF、BFWD和BFWI的總皂苷的含量測(cè)定

2.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 根據(jù)陳衍武等［6］的方法，取干燥至恒重的人參皂苷Re，精密稱(chēng)定，加水制成每毫升含0.1mg的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液10、20、40、80、120、160、180、240μL人參皂苷Re對(duì)照液于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，60℃水浴加熱15min，立即以冰水冷卻5min，加入5mL冰醋酸，搖勻，靜置10min后，于λ=550nm處，測(cè)定吸光度。

2.4.2.2 樣品液的制備 取干燥至恒重的BF約25mg置500mL容量瓶中，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解至刻度，搖勻，精確量取樣品，按照上訴方法測(cè)定吸收度。

2.4.3 BF、BFWD和BFWI總酚的含量測(cè)定

2.4.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 根據(jù)楊光明等［7］的方法，配置Folin-Ciocalteu試劑，置于冰箱中可以長(zhǎng)期保存。取干燥至恒重的沒(méi)食子酸精密稱(chēng)定，加水制成每毫升含0.1mg的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液以沒(méi)食子酸為對(duì)照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4mL置于25mL量瓶中，向量瓶中依次加入10.0mL蒸餾水，再各加入Folin-Ciocalteu顯色劑2.0mL，充分振蕩后靜置6～8min，分別加入15％Na2CO3溶液2.0mL，搖勻，在室溫下避光放置反應(yīng)2h。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度A。

2.4.3.2 樣品液的制備 取干燥至恒重的BF 19.6mg置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使其濃度相當(dāng)于784μg/mL的樣品液供分析用。按照上訴方法測(cè)定吸收度。

3 結(jié)果

3.1 荔枝核95％乙醇提取物（LCF）對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用 見(jiàn)圖1。

圖1 LCF對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

圖1表明：LCF的抑制率與陽(yáng)性藥（阿卡波糖）的抑制率在相同濃度下基本相同，LCF對(duì)酶的抑制活性呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

3.2 LCF對(duì)高脂高糖糖尿病模型大鼠血糖的影響 見(jiàn)表1。

表1 對(duì)各組糖尿病大鼠血糖的影響 mmol/L

3.3 荔枝核各部位對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果 取各提取物的濃度分別為0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1mg/mL時(shí)，測(cè)定酶抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2表明：LCF的抑制率與陽(yáng)性藥（阿卡波糖）的抑制率在相同濃度下基本相同，但隨著對(duì)抑制組分的逐步純化，在相同濃度下各純化部位抑制率均高于阿卡波糖。其中在各濃度下BFWI的抑制率最高。

圖2 各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

3.4 BF、BFWD和BFWI的總糖、總皂苷、總酚的含量測(cè)定結(jié)果

3.4.1 總糖含量 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程：A=0.078C+0.011（r=0.995 4），根據(jù)回歸方程，求得各部位的總糖含量見(jiàn)表2。

表2 各部位含量測(cè)定結(jié)果的比較 ％

3.4.2 總皂苷含量 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制配制人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程：A=0.004 2C-0.051 5（r=0.997 6），根據(jù)回歸方程，求得各部位總皂苷含量見(jiàn)表2。

3.4.3 總酚含量 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制配制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程：A=0.005 57C+0.005（r=0.999 0）。根據(jù)回歸方程，求得各部位的總酚含量，見(jiàn)表2。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LCF對(duì)α-葡萄糖苷酶有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠也有很強(qiáng)的降血糖作用，因此選擇α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)作為活性跟蹤的手段。本實(shí)驗(yàn)中，各提取物與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的抑制率比較為BFWI＞BF＞BFWD＞LCF，即隨著對(duì)活性組分的逐步純化，活性部位逐步集中，從而證明選用本實(shí)驗(yàn)的提取方法特別是對(duì)BF采用水溶解的分離方法是簡(jiǎn)單、有效的。通過(guò)對(duì)它們化學(xué)性質(zhì)的研究，BF、BFWD和BFWI的總糖和總酚含量均無(wú)明顯差別，而總皂苷的含量差別較大，分別為21.96％、6.54％、46.06％。綜上可以推斷皂苷類(lèi)物質(zhì)可能是抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效組分。本項(xiàng)研究工作確定了荔枝核的降血糖有效部位和該部分的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)其化學(xué)成分的分離、鑒定工作正在進(jìn)行。

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