HPLC法測(cè)定倒扣草中蛻皮甾酮的含量

　　摘 要：目的：建立HPLC法測(cè)定倒扣草中蛻皮甾酮含量的方法。方法：采用HPLC法，色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈–水體積比（18∶82）；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL.min-1。結(jié)果：蛻皮甾酮在0.25~2.5μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r＝0.999 8），平均回收率為98.76%，RSD為0.72%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、具有良好的重復(fù)性和回收率，可作為蛻皮甾酮的定量分析方法。
　　關(guān)鍵詞：HPLC；倒扣草；蛻皮甾酮
　　中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2011）04-0068-02
　　倒扣草，別名牛舌大黃、牛舌頭、魚鱗菜^［1］，來源于莧科植物粗毛牛膝Achyranthes aspera L.的全草。性涼，味甘淡。有解表清熱，利濕活血的功效，用于感冒發(fā)熱、痢疾、瘧疾、咽喉腫痛、腳氣、水腫、淋病、跌打損傷等^［2］。在全國各地均有分布，在四川是一味民間常用的中草藥，用來治療咽喉炎和扁桃體炎。有文獻(xiàn)報(bào)道^［3］，倒扣草當(dāng)中含有蛻皮甾酮類物質(zhì)，藥理研究表明，蛻皮甾酮具有明顯的抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗脂質(zhì)過氧化作用，能降低血清中膽固醇含量，減少血小板聚集性等作用。
　　本文以蛻皮甾酮為檢測(cè)指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定倒扣草中蛻皮甾酮的含量。
　　1 儀器與試藥
　　1.1 儀器 戴安高效液相色譜儀（P680A四元低壓梯度泵，PDA-100二極管陣列檢測(cè)器，TCC-100柱溫箱，Chromeleon色譜工作站）；瑞士Precisa電子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司，功率250 W，頻率25 kHz）。
　　1.2 試藥 蛻皮甾酮對(duì)照品（天津一方科技有限公司，純度為99.99%）。甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。倒扣草，2009年9月采自四川省瀘州市龍馬潭區(qū)石洞鎮(zhèn)，野生，經(jīng)筆者鑒別為莧科植物粗毛牛膝的全草。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 色譜條件 色譜柱為依利特 SinoChrom ODS-BP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈–水體積比（18∶82）；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL?min-1；進(jìn)樣量：10 μL。見圖1。
　　A.對(duì)照品；B. 供試品；1. 蛻皮甾酮
　　2.2 對(duì)照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含蛻皮甾酮0.125 mg/mL的溶液，即得。
　　2.3 供試品溶液的制備 精密稱取干燥倒扣草粉末（過40目篩）約2 g，用25 mL 80%甲醇超聲提取30 min，過濾，并以甲醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，置水浴鍋上揮干溶劑后，用色譜甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
　　2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取蛻皮甾酮對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x）與對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）作回歸處理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=31.2172 x+0.252 3（r=0.999 8）。結(jié)果表明，蛻皮甾酮在0.25~2.5 μg，進(jìn)樣量與峰面積間均呈良好的線性關(guān)系。
　　2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積值，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果倒扣草蛻皮甾酮的RSD為0.29%。表明本法精密度良好。
　　2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0.5、1、2、4、6、8 h分別精密吸取10 μL，測(cè)定峰面積值，結(jié)果倒扣草蛻皮甾酮的RSD=1.63%?？梢姽┰嚻啡芤涸? h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
　　2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批倒扣草粉末5份，按2.3項(xiàng)下方法，制備供試液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果倒扣草蛻皮甾酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD=0.61%。表明本法重現(xiàn)性良好。
　　2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量倒扣草藥材5份，每份加入適量對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法，制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果倒扣草蛻皮甾酮的平均加樣回收率為98.76%，RSD為0.72%。
　　2.9 樣品測(cè)定 分別取上述倒扣草藥材樣品，按2.3項(xiàng)下方法，制備供試液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件，分別測(cè)定樣品中蛻皮甾酮的含量。測(cè)定結(jié)果見表1。
　　3 討論
　　3.1 提取方法的選擇 配制供試品溶液時(shí)采取了不同的提取方法（超聲、回流、索氏提?。?，不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水和流動(dòng)相），不同溶劑體積（10、25、50、100 mL）及不同提取時(shí)間（15、30、45、60 min）分別考察，結(jié)果以25 mL 80%甲醇超聲提取30 min含量最高，雜質(zhì)峰較少。
　　3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器在190～380 nm范圍內(nèi)分別掃描蛻皮甾酮對(duì)照品、供試品溶液中蛻皮甾酮峰的紫外吸收，對(duì)照品和供試品中的蛻皮甾酮均在248 nm有最大吸收，故選用248 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
　　3.3 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 HPLC法測(cè)定倒扣草蛻皮甾酮含量的實(shí)驗(yàn)過程中試用過乙腈-水（18∶82）、乙腈-水（50∶50）、甲醇-水（30∶70）、甲醇-水（70∶30）等不同的流動(dòng)相，其中以乙腈-水（18∶82）為流動(dòng)相時(shí)，峰的分離程度和峰的形狀較好，故選擇作為最佳測(cè)定流動(dòng)相條件。
　　參考文獻(xiàn)：
　?。?］蕭步丹.嶺南采藥錄［M］.廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，2009：87~88.
　　［2］《全國中草藥匯》編寫組.全國中草藥匯編［M］.上冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：205.
　?。?］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化工出版社，2003：194~200.
　　
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