氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定復(fù)合調(diào)味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蔣 俊 沈 波

（江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定復(fù)合調(diào)味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蔣 俊 沈 波

（江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

建立高鹽高氨基酸復(fù)合調(diào)味料中微量苯甲酸的氣相色譜毛細(xì)管色譜柱檢測(cè)方法。調(diào)節(jié)樣品水溶液至酸性而改變其在有機(jī)相和水相中分配比。用乙醚高速勻漿的方法多次提取，去除鹽類和氨基酸等雜質(zhì)后濃縮。苯甲酸用氣相色譜毛細(xì)管色譜柱分離，F(xiàn)ID檢測(cè)器定量檢測(cè)，質(zhì)譜定性。結(jié)果表明：該方法在2.0～60.0mg/L的線性關(guān)系為R2＞0.999，最低檢 測(cè) 限 （LOD）達(dá) 到 1.0mg/kg，定 量 限 （LOQ）為3.0mg/kg，檢出限加標(biāo)回收率在89.0%～99.2%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5%。說(shuō)明該方法具有高靈敏性和專屬性，能對(duì)微量苯甲酸進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量檢測(cè)，是行之有效的檢測(cè)方法。

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用；苯甲酸；復(fù)合調(diào)味料

苯甲酸是最常用的防腐劑之一，在一定條件下能對(duì)霉菌和酵母菌的繁殖起到抑制作用，起到延長(zhǎng)食品保存時(shí)間的功效，是大多數(shù)國(guó)家允許使用的食品防腐劑，但過(guò)量食用對(duì)人體有害，因而，許多國(guó)家的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都規(guī)定了最大允許使用量［1］。在進(jìn)出口貿(mào)易中，日本等國(guó)家對(duì)苯甲酸的限量要求極為苛刻，僅為1mg/kg。中國(guó)GB 2760——2007規(guī)定，復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸的最大使用限量為600mg/kg［2］。GB/T 23495——2009方法規(guī) 定 的 苯 甲 酸 檢 測(cè) 限 為 1.8mg/kg［3］；GB/T 5009.29——2003方法規(guī)定的苯甲酸的檢測(cè)限為1mg/kg［4］。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定防腐劑的方法有很多，如光譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法、分光光度法等［5－9］，使用最多的是色譜法，并有大量文獻(xiàn)報(bào)道［10－13］，但未見(jiàn)復(fù)合調(diào)味料中低含量苯甲酸檢測(cè)的相關(guān)資料。復(fù)合調(diào)味料基質(zhì)復(fù)雜，含高鹽高氨基酸，干擾嚴(yán)重，檢出限遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，且極易出現(xiàn)假陽(yáng)性，不能滿足低殘留量苯甲酸的檢測(cè)要求，必須經(jīng)質(zhì)譜定性。許秀敏等［14］曾報(bào)道液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定性分析，液相色譜紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。本試驗(yàn)基于2010年度中國(guó)進(jìn)出口食品安全衛(wèi)生殘留計(jì)劃中對(duì)復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸的檢測(cè)要求，使用氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，F(xiàn)ID定量檢測(cè)，并用質(zhì)譜進(jìn)行定性確證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

石油醚，乙醚，無(wú)水硫酸鈉，氯化鈉，鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑一廠；

水：一級(jí)水，優(yōu)普超純水機(jī)制備；

衍生化試劑：雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）＋三甲基氯硅烷（TMCS）（99＋1），美國(guó)REGIS公司；

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

7890N氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）－串聯(lián)5975CInert MS質(zhì)譜：美國(guó)Agilent公司；

旋渦混勻器：XW－80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BuCHI R－200，瑞士BuCHI公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：H2050R，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

高純度氫氣發(fā)生器：SJPH－300A，北京中惠普分析技術(shù)研究所；

超純水機(jī)：UPH－IV－20T，南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司；

氮吹儀：TuboVap LV，美國(guó)Caliper公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 FID定量 色譜柱：HP－innowax（30m×0.25mm×0.25μm）；氮?dú)饬魉伲?mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測(cè)器溫度：250℃；柱溫：100℃保持1min，40℃/min升至180℃保持2min，10℃/min升至230℃保持2min，10℃/min升至240℃保持2min，10℃/min升至250℃保持10min。進(jìn)樣方式：分流；分流比：20∶1。進(jìn)樣量：1μL。

1.3.2 MSD定性確證

（1）色譜條件：色譜柱：DB－5MS UI（30m×0.25mm×0.25μm）；氦氣流速：1mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃；柱溫：80℃保持3min，30℃/min升至300℃保持2min；接口溫度：280℃；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1μL。

（2）質(zhì)譜條件：離子源：150℃，四級(jí)桿：230℃，scan模式全掃描，溶劑延時(shí)5min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 0g，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑溶解，定容至100mL，此混合溶液每毫升相當(dāng)于1.0mg苯甲酸。再移取10mL濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑定容，如此稀釋成10μg/mL的苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0mL濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑定容，得到2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0μg/mL不同濃度梯度苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取5.0g試樣，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加鹽酸（1＋1）酸化，調(diào)節(jié)pH值1到2之間，用20mL乙醚渦旋提取1min，4 000r/min離心5min，收集乙醚層于30mL玻璃試管中，40℃水浴上氮?dú)獯蹈伞Ｔ儆?0mL乙醚渦旋提取1min，4 000r/min離心5min，收集乙醚層于同一玻璃試管中，40℃水浴上氮?dú)獯蹈伞Ｓ?0mL乙醚，將30mL玻璃管中殘?jiān)慈?0mL玻璃試管中，40℃水浴上氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確移入1mL石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑溶解殘?jiān)玫酱郎y(cè)液。

1.3.5 樣品測(cè)定 按照1.3.4進(jìn)行樣品前處理，1.3.1和1.3.2條件進(jìn)行定量測(cè)定和定性確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性回歸方程

對(duì)濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析（標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖見(jiàn)圖1），得到質(zhì)量濃度X與峰面積Y的工作曲線，線性與相關(guān)系數(shù)良好。回歸方程為：Y＝47 923X－28 805；線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 6。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間：10.941min。

圖1 實(shí)際樣品局部色譜圖（FID）Figure 1 Partial chromatogram of real samples（FID）

2.2 檢測(cè)低限

按色譜峰高是基線噪聲高度3倍為有效信號(hào)計(jì)算檢出限（LOD），在本試驗(yàn)條件下，苯甲酸的檢出限為1mg/kg；基線噪聲高度10倍為有效信號(hào)計(jì)算定量限（LOQ），在本試驗(yàn)條件下，苯甲酸的定量限為3mg/kg。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度計(jì)算

將待測(cè)樣品和加標(biāo)樣品進(jìn)行6次試驗(yàn)，對(duì)所得的試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算精密度，具體結(jié)果見(jiàn)表1，樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 苯甲酸在不同添加水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and RSDs of benzoic acid spiked at differentl evels（n＝6）

采用加標(biāo)測(cè)定回收率的方法來(lái)計(jì)算準(zhǔn)確度。將濃度適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液按本試驗(yàn)所述方法進(jìn)行測(cè)定，回收率為80%～98%。

2.4 前處理優(yōu)化

苯甲酸為弱酸，pKa值為4.76，在酸性條件下（pH在1到2之間），以酸的形式存在，易溶于石油醚和乙醚。復(fù)合調(diào)味料基質(zhì)復(fù)雜，提取過(guò)程中需加入酸來(lái)抑制電離，減少在水相中的分配比。按GB/T 5009.29——2003第一法所用的鹽酸量不足以使試樣呈酸性，苯甲酸在電離狀態(tài)下在水相中溶解度較大，嚴(yán)重降低乙醚萃取效率，故本試驗(yàn)加大鹽酸溶液用量，最終以調(diào)節(jié)試樣溶液pH值來(lái)決定鹽酸溶液用量。

2.5 質(zhì)譜定性試驗(yàn)

按1.3.4處理的待測(cè)液，用1.3.2的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，從總離子流圖中提取122、105、77、51四離子，得到提取離子色譜圖（圖2），扣除背景后得到質(zhì)譜圖（圖3）與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中的苯甲酸匹配度為98%。

圖2 樣品提取離子色譜圖Figure 2 Extracted ion chromatograms

圖3 提取離子的質(zhì)譜圖Figure 3 Extracted ion mass spectrum

2.6 柱前硅烷化衍生

甘平勝等［15］利用質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性，直接對(duì)奶粉中低含量殘留的苯甲酸定性定量。在質(zhì)譜定性確證試驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)部分苯甲酸被硅烷化后的產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果表明苯甲酸的羥基氫活性較強(qiáng)，有可能被毛細(xì)管柱填料的硅烷基取代，峰型嚴(yán)重拖尾、重復(fù)性和線性相關(guān)性很差，難以準(zhǔn)確定量。

取10μg/mL苯甲酸標(biāo)品溶液100μL，氮?dú)獯蹈桑尤?00μL吡啶和200μL衍生化試劑，70℃水浴反應(yīng)40min，供GC－MSD檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：HP－5MS（30m×250μm ×0.25μm）；柱溫：110℃保持4min，30℃/min升至180℃保持3min；氦氣流速：1mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：280℃；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1μL。硅烷化后的特征離子有179、135、105、77、121等，峰形有較大改善，靈敏度提高，重復(fù)性良好，可以建立為痕量苯甲酸殘留的定量檢測(cè)方法，提取離子圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 衍生后的提取離子色譜圖Figure 4 Extracted ion chromatograms of derivatized

圖5 衍生后的質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrum of derivatized

3 結(jié)論

本試驗(yàn)基于氣相色譜法檢測(cè)苯甲酸的基礎(chǔ)上，對(duì)前處理優(yōu)化，建立了一種高效、快速的利用氣相色譜法檢測(cè)復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸微量殘留的檢測(cè)方法，并使用質(zhì)譜進(jìn)行定性確證，防止了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。該方法有效解決了基質(zhì)復(fù)雜，高鹽高氨基酸樣品中微量苯甲酸殘留的檢測(cè)困難，其精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性都可以滿足日常檢測(cè)工作的需要，適宜其他樣品的日常檢測(cè)。

1 張紅，陳子雷，王文博，等.肉制品中山梨酸、苯甲酸的氣相色譜分析方法的研究［J］.食品科技，2007（2）：234.

2 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB2760——2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

3 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 23495——2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定 高效液相色譜法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

4 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T5009.129——2003食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

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6 K C Waldron，Li J.Investigation of a pulsed－laser thermo－optical absorbance detector for the determination of food preservatives separated by capillary electrophoresis［J］.J.Chromatogr：B，1996，683（1）：47～54.

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8 Xie Y T，Chen P，Wei W Z.Rapid analysis of preservatives in beverages by ion chromatography with series piezoelectric quartz crystal as aetector［J］.Microchem，1999，61（1）：58～68.

9 桑宏慶，蔡華珍，王大勇.紫外分光光度法同時(shí)測(cè)定飲料中山梨酸鉀和苯甲酸鈉［J］.檢測(cè)與分析，2006.8（9）：34～35.

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11 Techakriengkrai I，Surakarnkul R.Analysis of benzoic acid and sorbic acid in Thai rice wines and distillates by solid－phase sorbent extraction and high－performance liquid chromatography［J］.Food Compos Anal.，2007，20（3）：220～225.

12 陳子雷，張紅，王文博，等.氣相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中山梨酸和苯甲酸的含量［J］.食品與藥品，2006，11（8）：52～54.

13 Fernando J M Mota，Isabel M P L V O Ferreira，Sara C Cunha，et al.Optimisation of extraction procedures for analysis of benzoic and sorbic acids in foodstuffs［J］.Food Chemistry，2003，82（3）：469～473.

14 許秀敏，吳西梅，梁春穗，等.液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（9）：1 057.

15 甘平勝，黃聰，于鴻，等.氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定奶粉中苯甲酸（鈉）含量［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（1）：75～76.

Study on the trace determination of benzoic acid in compound seasoning powder by gas chromatography－tandem mass spectrometry

WANG Zu－xiang ZHOU Hong－bin JIANG JunSHEN Bo

（Zhenjiang Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhenjiang，Jiangsu212008，China）

To establish a method of capillary gas chromatography for the determination of benzoic acid in compound seasoning powder which contain high concentrations of salts and amino acids.Change the distribution ratio of samples in the organic phase and water by adjusting the solution to acidic.The sample was mashed several times at a high speed，and extracted with diethyl ether then concentrated after removed impurities such as salts and amino acid.Benzoic acid was separated by GC with capillary column，detected quantitatively by FID and identified by mass.Within the concentrations of 2.0～60.0mg/L，the calibration curve showed good linearity with the correlation coefficient（R2）＞0.998.The limit of detection（LOD）was 1.0mg/kg，while the limit of quantification（LOQ）3.0mg/kg.At the spiked levels of LOD，the recovery rate was 89.0%～99.2%.The relative standard deviation range of samples added standard substance was（RSD）＜5%.This method is sensitive and special features in identify and determination of trace benzoic acid.It is a feasible method.

GC－MSD；benzoic acid；compound seasoning powder

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.026

王祖翔（1983－），男，江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局助理工程師。E－mail：wang＿zuxiang＠163.com

2011－03－11